前言
宫颈癌是一种严重危害女性健康的恶性肿瘤。根据国家癌症中心统计的数据，2022年我国宫颈癌新发15万例，死亡5.5万例，发病例数和死亡例数都超过了其他妇科肿瘤的总和[1]。早期宫颈癌（≤IB2期）通常通过手术治疗，2年复发风险为8%-10%；晚期采用放化疗，2年复发风险为30%-50%。对于接受过浸润性宫颈癌治疗的女性，定期进行常规临床检查，必要时进行辅助影像学检查，例如磁共振成像（MRI）或计算机断层扫描（CT）。然而，目前尚无可靠的监测标志物来预测哪些患者在宫颈癌治疗后更有可能复发，血浆游离肿瘤HPV（HPV ctDNA或ctHPV）是一种潜在的生物标志物[2]。
ctHPV和分子残留病灶检测
HPV是一种嗜上皮组织的无包膜双链环状小DNA病毒，病毒基因组约8 kb，可分为3个区域：早期基因（包含开放阅读框E6、E7、E1、E8、E2、E4、E5，4.5kb）、晚期基因（包含开放阅读框L2和L1，2.5kb），以及非编码上游调节区（URR）又称为长控制区（LCR，1kb）。HPV基因组序列存在10%以上的不同，即为不同的基因型别。目前已发现并分离鉴定出200多种HPV型别，并按其诱发癌症的潜力，分为高危型与低危型。其中HPV16/18型占比约70%[3]。
▲HPV病毒基因组结构和电镜下的HPV分子[4]
E6和E7是与宫颈癌关联最紧密的致癌基因。在高危型HPV（hrHPV）持续感染期间，HPV DNA通常会整合到宿主基因组中，其负调节因子E1和/或E2被破坏，导致病毒癌基因E6和E7表达失调[5]。E6和E7蛋白分别与p53和pRb结合，导致细胞中抑癌蛋白水平显著降低，宿主染色体不稳定，DNA的复制出现紊乱而诱发肿瘤[2]。也有研究通过Nanopore分析HPV16型的整合方式，发现有部分病毒E6/E7并未整合到基因组中，但占比很低[5]。
分子残留病灶（MRD）是指经过治疗后，传统的影像学检查或实验室检测方法不能发现，但通过细胞分子生物学方法在血液等液体活检中发现的肿瘤来源分子异常，提示肿瘤细胞持续存在或临床进展可能。ctDNA是指主要来源于原发肿瘤、转移灶或循环肿瘤细胞等释放到循环系统中的肿瘤基因组片段，其携带肿瘤特异性遗传或表观遗传变异，可实时反映体内肿瘤状态，是临床应用最广泛的液体活检生物标志物之一[6]。
ctDNA中体细胞突变的等位基因频率（VAF）很低，即便在晚期/转移性癌症（III/IV期）中，平均VAF为3.67%，中位VAF仅为0.41%[7]，因此需要较高的测序深度才能有效提高变异检出的灵敏度[6]。由于HPV是绝大多数宫颈癌的病因，并且在细胞中以多个拷贝形式存在，因此也应以ctDNA的形式释放，它是一种潜在的生物标志物[2]。ctHPV在总cfDNA中不受高野生型背景的干扰，比点突变更容易检测和鉴别，且无需定制化流程。
▲宫颈癌ctHPV检测的概览[2]
ctHPV检测在宫颈癌中的应用
PAIR-HPV前瞻性研究（NCT02554565）纳入了55例根治性放化疗（CRT）一线治疗的患者，主要为II-IVA期。在CRT治疗前，69%的患者成功检测到HPV ctDNA。HPV ctDNA水平与肿瘤中HPV拷贝数（r=0.41，p<0.001），肿瘤分期（p=0.037）和淋巴结状态（p=0.02）相关。CRT结束时和随访期间，HPV ctDNA阳性与较低的无病生存（DFS，p=0.048）和总生存（OS，p=0.0013）相关[8]。
▲ctHPV检测结果提示患者预后[8]
BioRAID研究（NCT02428842）入组了419例患者，94例纳入无进展生存（PFS）分析。73%的患者为FIGO III/IV期，均为16/18型，其中20%手术，65%放化疗，15%新辅治疗。研究采用HPV E7基因作为标志物。在治疗前，63%的患者检测到HPV ctDNA。HPV ctDNA阳性与FIGO高分期（p=0.02）和主动脉旁淋巴结受累（p= 0.01）相关。HPV ctDNA水平与肿瘤中HPV 拷贝数呈正相关（r=0.39，p<0.001）[9]。
研究发现基线时的HPV ctDNA检测结果与PFS无关（HR=1.59；p=0.19）；治疗后HPV ctDNA阳性与更短的PFS相关（p<0.0001）。44例随访患者，取治疗结束时（EOT）/随访过程样本进行监测。除一例患者以外，EOT ctHPV阴性患者在随访期间保持阴性。75%的EOT ctHPV阳性患者的在随访期间仍为阳性，且全部复发；2例随访期间清除ctHPV的患者未复发。ctHPV检出阳性较临床确诊复发的中位提前时间为10个月（2~15个月）[9]。
▲ctHPV检测结果与患者PFS的关系（A、基线检测，B、EOT检测）[9]
▲从EOT到随访结束，ctHPV的监测结果[9]
瑞典的一项研究纳入74例局部晚期宫颈癌患者，采用数字PCR（ddPCR）的方法分析了418个血浆样本，中位随访时间为37个月。92.4%的治疗前样本ctHPV阳性。血浆中持续存在的ctHPV与较差的PFS相关（P < 0.001）。早期随访时ctHPV状态预测疾病进展的阳性预测值（PPV）为87.5%，阴性预测值（NPV）为89.3%。在所有（10例）完全应答后复发的患者中，ctHPV检出阳性较影像学诊断复发的中位提前时间为315天[10]。
ctHPV检测在口咽癌中的应用
除宫颈癌以外，头颈部鳞癌、肛门癌、阴道癌、外阴癌等癌种均有一定比例是由HPV感染所致。近年来，欧美国家口咽癌的发病率明显上升，研究提示大部分与HPV感染具有直接关系。我国同样有逐年升高的趋势。基于一项针对HPV16检测的meta分析，国内头颈部肿瘤的HPV16总体感染率为24.7%，口咽癌的比例为31.6%。近期一项基于WHO数据库的研究显示，中国HPV阳性口咽癌的比例为25.8%[11]。
美国Naveris公司主导的研究（NCT02281955、NCT03077243、NCT0316182）分析了45例患者的509份血液样本，中位随访时间为19.2个月。37例患者在治疗后所有时间点均未检测到ctHPV，无患者复发，NPV为100%。8例患者在治疗后监测期间出现ctHPV阳性，其中4例被活检证实复发。这4例患者连续2次ctHPV阳性，PPV为100%。ctHPV阳性与活检证实复发之间的中位提前时间为6.6个月（3.3-12.9个月）[12]。
▲连续2次ctHPV监测异常的患者复发风险更高[12]
▲ctHPV监测有助于早期发现疾病复发[12]
日本的一项研究在35例接受放疗联合或不联合化疗的HPV16相关头颈部鳞癌患者中使ddPCR定量检测ctHPV16 DNA。中位随访21个月后，ctHPV16 DNA和PET-CT的NPV相似（89.7% vs 84.0%），而ctHPV16 DNA的PPV远高于PET-CT（100% vs 50.0%）[13]。CSCO头颈部肿瘤诊疗指南也在注释中提到“对于HPV相关的口咽癌，近期有研究显示治疗后定期进行外周血HPV DNA的拷贝数（检测）有助于早期发现肿瘤复发”[11]。相信这一监测方案不久之后会被写入指南。
ctHPV的检测方法和注意事项
早期的ctHPV研究都有一个共同点，即灵敏度相当差，大多数仅为6.9%~30%。原因可能是多方面的。荧光定量PCR（qPCR）的方法不够灵敏，无法检测微量的ctHPV。血浆样本的采样量、保存、处理方法对检测结果亦有影响[2]。2016年，Jeannot等人发表了第一项使用ddPCR检测血浆中ctHPV DNA的研究。在47例HPV16/18阳性的宫颈癌患者中，他们使用ddPCR（16/18 E7）在83%的病例的治疗前血浆中发现了ctHPV DNA，而使用qPCR时，这一比例仅为60%（p=0.02）[14]。
靶向HPV的高通量测序（HPV-seq）也是可选的方法之一。研究发现HPV-seq（靶向HPV和鳞癌中12个高频突变基因）在细胞系数据中重现了小于0.6拷贝水平的检测限。HPV-seq与ddPCR结果具有高度一致性（r2=0.95，p=1.9×10-29）。HPV-seq可以检测出ddPCR检测阴性的、治疗后低至0.03拷贝/mL血浆中的ctDNA。治疗结束时HPV ctDNA阳性与较差的PFS相关，检测复发的敏感性为100%，特异性为67%（ddPCR法均为75%）[15]。
前瞻性、多中心验证研究（NCT03853915、NCT03702309）纳入了70接受CRT治疗的IB-IVA期宫颈癌患者。分别在基线时、CRT结束时、CRT后4~6周和CRT后3个月采集患者的外周血，同时使用ddPCR和HPV-seq两种方法检测ctHPV水平。主要终点为2年的PFS率，中位随访时间为2.2年，70例HPV阳性宫颈癌患者中有24例PFS事件。HPV-seq显示出与ddPCR相似的结果。与ctHPV阴性的患者相比，在CRT结束时、CRT后4~6周和CRT后3个月，ctHPV阳性的患者2年的PFS显著更差。无论采用ddPCR还是HPV-seq，与影像学相比，发现复发的中位提前时间为5.9个月[16]。
▲这两种检测方法一致显示：ctHPV快速清除的患者，具有更好的PFS，其次是逐渐清除的患者；而ctHPV升高的患者，PFS显著更差[16]。
需要注意的是，ctHPV定量检测不适用于健康女性或癌前病变患者的筛查。9项采用qPCR法的研究和最近几项基于ddPCR法的研究均未在癌前病变患者血浆中检出ctHPV；唯一检出的研究中，血浆中的HPV状态与宫颈样本的相关性相当差（44%）。大多数在健康女性中使用qPCR或ddPCR检测ctHPV的检出率仅为0%至2%。ctHPV在早期患者中的阳性率也较低，I~II期宫颈癌患者基线ctHPV阳性率为24.1~65%；晚期（III~IV期）患者基线ctHPV阳性率可达到63~100%[2]。
总结
ctHPV检测的是整合到人类基因组，并释放到血浆中的HPV游离DNA的E6/E7基因，用于分子残留病灶（MRD）检测，可以辅助预测治疗效果，更可提早数月提示疾病复发。飞朔生物的人ctHPV16/18型定量检测采用数字PCR法，灵敏度可达到1-3拷贝/反应，而且实验操作简便，报告周期短。飞朔生物致力于为肿瘤个体化精准医学检测提供最具创新性的产品和服务，并持续更新现有产品。
参考文献
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[4] Semin Immunopathol. 2020 Apr;42(2):159-171.
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[16] J Clin Oncol. 2024 Feb 1;42(4):431-440.
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