引言

干细胞微环境是在空间层面定义的组织微环境，其包括细胞、信号和细胞外基质。微环境中复杂多样的通信网络负责在生理和疾病状态下调节干细胞增殖和分化。多项研究表明，干细胞微环境的空间位置决定了细胞的命运。但目前，血管周围干细胞微环境的定义尚不明确。多谱系间充质祖细胞存在于动脉和静脉的外膜层adventitia中。作为天然的间充质干细胞，它们可能对血管更新和修复以及病理性血管重塑发挥着重要作用，因为是细胞治疗的重要种子细胞来源。例如，adventitia中的Gli1+细胞可导致纤维化和血管钙化，而在血管周围区域表达的CD10和CD107a分别表征骨祖细胞和脂肪祖细胞。针对这些标记物的免疫组织化学检测还表明，间充质祖细胞的离散亚群占据了动脉和静脉周围不同的同心环状区域。然而，目前尚不明确adventitial微环境内间充质祖细胞的表型和功能属性。

近日，霍普金斯大学的Aaron James团队在Developmental Cell杂志发表了题为Integrated transcriptomics of human blood vessels defines a spatially controlled niche for early mesenchymal progenitor cells的文章。该研究证实了人类血管周围微环境内存在表型、功能和空间上明确的间充质祖细胞亚群。通过标志物CD201的空间分布，部分揭示了血管周围干细胞生态位的多样性。其中局限于血管adventitia层外层的CD201（内皮蛋白C受体）高表达细胞是更原始的间充质祖细胞样细胞，并且CD201Low细胞是具有更大分化潜力的定向祖细胞样细胞。同时，与CD201High细胞相比，CD201Low细胞显示出更好的骨再生潜力。并且，通过下游分析发现，经典Wnt信号通过调节DACT2调节血管周围干细胞表型。

研究者首先利用空间转录组学描绘了人类皮下脂肪组织中动脉和静脉外膜层adventitia的空间特征，并进一步分析了动脉和静脉的血管间异质性，描绘了血管周围干细胞微环境。不仅准确地绘制了血管壁的从里到外三层结构（Intima, Media, Adventitia），而且揭示了adventitia可进一步分成里（inner）和外（outer）两层。接下来，为了加深对人类adventitia内空间层次多样性的理解，研究者在FACS分离CD34+CD31－CD45－CD146－adventicytes后，立即进行scRNA-seq。首先，识别出均表达高水平间充质祖细胞标志物的三个细胞亚群（cluster1, 2, 3），并且识别出五种在各亚群之间存在差异表达、且均未在血管周围细胞中被描述过的细胞表面分子，通过拟时序分析表明cluster2是最原始的细胞类型。它会产生其他两种细胞类型cluster1和cluster3。为了进一步探索inner adventitia和outer adventitia内细胞亚群的位置，研究者整合了scRNA-seq和空间转录组学数据，预测出cluster2（CD201+）在outer adventitia定位的可能性更高，cluster1（CD304+）在inner adventitia定位的可能性更高，而cluster3（CD141+）的存在水平较低，并均匀分布在outer adventitia上。总之，研究者指出CD201可特异性识别具有祖细胞属性的间充质细胞，并且这类细胞（CD201+）位于outer adventitia层。为了进一步验证上述分析结果，研究者结合免疫荧光染色观察到CD201与CD34（adventitia标记物）存在原位共定位表达。该结果直接证实outer adventitia主要含有CD201+细胞，并且结合CytoTRACE分析表明CD201High亚群是原始祖细胞样细胞。再通过集落形成实验、成骨分化、成脂分化实验表明CD201High亚群具有更高的增殖能力，而CD201Low亚群成骨分化和成脂分化能力更强。在小鼠脂肪组织分离出CD201High/Low亚群也观察到了与人类组织相同的结果。而且CD201High亚群Wnt信号活性水平升高。总之，研究者指出CD201+在小鼠与人类中存在一致的outer adventitia生态位，CD201High细胞代表原始祖细胞样群体。研究者进一步分析RNA-seq数据发现，DACT2在CD201High细胞中表达最高，结合动脉免疫荧光染色也证实了outer adventitia共表达DACT2和CD201。通过敲低adventitia细胞中DACT2发现细胞增殖能力增强、成脂分化减弱和成骨分化增强，且证实了DACT2缺失引起的增殖和分化潜能变化与Wnt/β-catenin信号通路的显著紊乱有关，发现PROCR的表达随着DACT2敲低而增加。进一步PROCR敲低后，发现细胞增殖减少，成脂和成骨分化增强。综上所述，研究者证明PROCR+的adventitia祖细胞以空间限制的方式受Wnt信号传导的调控，并且Wnt抑制剂DACT2在此过程中起着关键作用。最后，研究者进行体内实验探究。使用HA/β-TCP作为支架载体负载CD201Low/High细胞进行小鼠背部皮下异位骨植入，以评估人类CD201Low/High细胞的体内成骨潜力。DXA和Micro-CT分析发现，与CD201High组和单纯HA/β-TCP组相比，CD201Low细胞的骨矿物质密度增加骨体积分数和总骨体积有所增加。HE染色、碱性磷酸酶（ALP）染色、骨钙素（OCN）免疫荧光染色也均证实了影像学结果。综上所述，研究者结合体内实验验证了CD201Low细胞的成骨能力强于CD201High细胞。综上所述，本研究结合单细胞测序和空间转录组学，鉴定了一种具有空间偏好性的和明确功能表型的血管周围间充质祖细胞新亚群（CD20High），解释了血管壁adventitia微环境的复杂性，明确了血管外膜adventitia是间充质祖细胞的真正“栖息地”，明确了adventitia间充质祖细胞的空间层次，并表现出精确的空间排布以及局部的分子调控。该研究不仅对探索血管如何应对损伤和疾病很有价值，而且有望提高细胞治疗所用的间充质祖细胞作为种子细胞制备的均一性，并最终提高细胞疗法的临床效果。此外，CD201Low细胞可能有助于体内骨再生，有望成为适用于未来临床转化的特异性祖细胞。

参考文献

https://www.cell.com/developmental-cell/abstract/S1534-5807(24)00393-9

责编|探索君

排版|探索君

文章来源|“BioArt”

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