大家好！今天要和大家分享一项关于蜱的有趣研究——《Phase separation and ageing of glycine-rich protein from tick adhesive》发表于《Nature Chemistry》。蜱在吸食宿主血液时，会分泌一种唾液，其中富含甘氨酸的蛋白质（GRP）起着关键作用。但此前其液体到固体的转变机制一直未知。这项研究深入探索了GRP的特性，包括其序列、相分离行为、老化过程等，为我们揭开蜱唾液蛋白质的神秘面纱，让我们一同走进这个微观世界，探寻蜱粘附的奥秘。
*本文只做阅读笔记分享*
一、研究背景
生物粘合剂在自然界中广泛存在，众多生物利用它们实现附着、捕食、运动等多种功能。然而，许多生物粘合剂的具体粘附机制仍不明确。蜱作为一种重要的寄生虫，其唾液中的蛋白质在形成稳固附着结构（水泥锥）方面起着关键作用，但其中的奥秘尚未完全揭开。此前研究发现，GRP在蜱唾液中含量丰富，且可能与水泥锥的特性有关，而内在无序蛋白质（IDPs）常与液-液相分离（LLPS）相关，这一现象在许多生物的粘附过程中发挥重要作用，因此促使研究人员深入探究蜱GRP在水泥锥形成中的潜在作用。
二、研究结果
（一）GRP的序列分析表明其为无序蛋白
研究人员选取了蜱唾液中的一种GRP（UniProtQ4PME3），其成熟序列tick-GRP77富含甘氨酸（约26%），同时含有大量非极性（约44%）和极性（约36%）氨基酸，疏水（约7%）和芳香族（约9%）残基相对较少。通过AlphaFold预测，其信号肽为α-螺旋，其余部分无序。IUPred算法及其他算法也证实tick-GRP77为高度无序蛋白。CIDER分析显示，tick-GRP77序列与许多已知的相分离IDR-包含蛋白相似，这表明它具有很强的LLPS倾向。例如，像FUS等蛋白也具有类似的无序特征并能发生相分离。
（二）Tick-GRP77通过简单凝聚发生LLPS
1、实验证据
合成tick-GRP77后，利用液滴蒸发实验模拟蜱唾液分泌过程。将缓冲后的tick-GRP77溶液（16-500μM）滴在亲水玻璃片上，随着蒸发，液滴边界处蛋白质浓度增加，最终形成凝聚物。例如，在32μMtick-GRP77溶液的蒸发实验中，可观察到液滴边界处荧光增强，随后出现相边界，形成凝聚物。
增加初始蛋白浓度会缩短凝聚开始的时间，如从16μM增加到128μM时，凝聚时间从12.7±0.7min缩短到7.5±0.9min。
表面钝化实验表明盐在促进相分离中起重要作用，如tick-GRP77在140mMNaCl中能形成凝聚物，而在Milli-Q水中则不能。
2、凝聚物性质
观察到tick-GRP77凝聚物的融合行为，如两个相似大小的凝聚物接触后融合成更大的球形凝聚物。通过分析融合过程中液滴的纵横比变化，计算出逆毛细管速度为0.92sμm⁻¹，表明凝聚物在一定时间尺度上表现为液体。
实验证实了LLPS过程的可逆性，如32μMGRP在PBS中形成凝聚物后，结晶样品经再水化可重新溶解，再次蒸发又能形成LLPS。
（三）LLPS主要由精氨酸和芳香族残基驱动
1、蛋白片段研究
将tick-GRP77分为N端（20-51）和C端（52-96），二者均无序且甘氨酸含量相近，但N端富含酸性氨基酸（净电荷-3.4），C端富含碱性氨基酸（净电荷2.5）。在相同条件下，C端凝聚速度更快（ti = 9min）且倾向于润湿玻璃表面，N端凝聚速度与tick-GRP77相似（ti = 13min）。这表明C端的阳离子-π和π-π相互作用更强，是LLPS的关键促进因素，而N端的静电排斥使其凝聚起始延迟。
2、突变体研究
合成C端的突变体（ΔFY和ΔR），发现芳香族氨基酸（F和Y）对诱导C端相分离至关重要，精氨酸（R）在驱动相分离中起更重要作用。例如，ΔFY突变体（50μM）凝聚变弱（ti = 7min），ΔR突变体（50μM）几乎不发生凝聚。这表明二者对tick-GRP77的LLPS均起主导作用。
3、化学干扰实验
尿素实验表明氢键在GRP凝聚过程中起积极作用，因为N端和C端凝聚物在约0.5M尿素存在下立即溶解。
1,6-己二醇实验显示疏水相互作用也参与LLPS，N端凝聚物在约15mM1,6-己二醇中溶解，C端凝聚物在约70mM1,6-己二醇中才开始溶解，完全溶解需约140mM。
（四）Tick-GRP77在磷酸盐存在下形成凝聚物
1、磷酸盐的影响
添加Na2HPO4可使tick-GRP77立即发生凝聚，通过实验得到相图，表明凝聚与蛋白浓度和孵育时间有关。例如，1M Na2HPO4存在下，63μM和125μMtick-GRP77溶液可瞬间凝聚，16μM溶液在1.5h孵育后也能形成凝聚物。
在拥挤环境（添加聚乙二醇）下，较低浓度的磷酸盐即可引发LLPS。如5%wt/volPEG（8kDa）存在时，0.5M磷酸盐就能使125μMtick-GRP77瞬间发生LLPS。
2、微流控实验
微流控实验中，tick-GRP77溶液与Na2HPO4溶液在芯片内相遇时，立即在界面形成凝聚物，且凝聚物在通道壁上变形，进一步证明了盐诱导的凝聚现象。
（五）Tick-GRP77凝聚物发生液-凝胶转变
1、液-凝胶转变现象
高浓度tick-GRP77（125μM）在Na2HPO4中孵育较长时间（5.5h）后，凝聚物的融合被阻止，形成稳定的簇，表明发生了液-凝胶转变。
2、FRAP实验验证
荧光恢复实验（FRAP）对比新鲜（0.5h）和老化（18h）的凝聚物，发现二者均表现出部分荧光恢复，表明GRP分子在凝聚物内运动受限，具有粘弹性行为；老化样品的荧光恢复率显著降低（新鲜样品约49%，老化样品约2%），表明其从液态转变为固态。通过计算得到新鲜样品的松弛时间τfresh = 160s，扩散系数Dapp约为-2.2×10-3μm2s-1，粘度约为42Pas，界面张力约为-46μNm-1，表明凝聚物为高粘性液体，能形成粘弹性网络并随时间老化，与蜱水泥锥形成过程相关。
3、粘附性测量
力谱测量表明，空气干燥的tick-GRP77凝聚物具有高粘附性，其粘附功Wadh为Wadh = 1.4×102 Jm-2，比非凝聚条件下（1.31×102 Jm-2）高四个数量级，可能在蜱的粘附中起关键作用。
（六）天然蜱唾液显示蛋白质凝聚物的证据
1、唾液提取与分析
从自然栖息地收集蜱（Ixodesricinus），提取未吸血雌性成虫的唾液腺内容物，SDS-PAGE分析显示提取物中有多种蛋白质条带。
2、凝聚物观察
显微镜观察发现多个唾液腺提取物中有微米级球形液滴，液滴融合事件表明其为液体性质。排除了液滴为脂质或脂肪滴的可能性。高盐浓度下出现纤维状结构，荧光标记实验表明这些结构富含蛋白质，暗示唾液中可能存在GRP丰富的凝聚物。比较tick-GRP77与其他蜱唾液中的GRPs，发现其氨基酸组成和模式相似，表明tick-GRP77的凝聚机制可能是一种更普遍的转变途径。
三、研究讨论
1、GRP在蜱水泥锥形成中的作用及生物粘附机制的普遍性
GRP通过LLPS和老化形成凝胶状粘附结构，可能在蜱的水泥锥形成中起关键作用。其他生物的粘合剂也涉及液-固转变，如天鹅绒虫的粘液蛋白和贻贝的足蛋白等，理解蜱GRP的相变可能揭示生物粘附蛋白的共同原理。
2、未来研究方向
分泌蛋白易发生翻译后修饰，其对GRP的影响值得研究；蜱唾液中的酶可能参与交联，有助于硬化过程，也需进一步探索。
GRP的粘附和生物相容性使其有望用于开发医疗密封剂；干扰GRP相变抑制水泥锥形成或开发抗蜱疫苗是控制蜱的潜在策略；基于GRP的凝聚物作为抗蜱疫苗载体也是有前景的研究方向。
通过这一系列研究，我们对蜱唾液中GRP的相分离和老化过程有了更深入的理解，这不仅有助于我们进一步探索蜱的生物粘附机制，也为开发新型蜱控制策略和生物医学应用提供了重要的理论基础。
四、一起来做做题吧
1、以下哪种生物的生物粘合剂机制在研究前相对清楚？（ ）
A. 蜱
B. 贻贝
C. 沙堡蠕虫
D. 天鹅绒虫
2、Tick - GRP77 中含量最高的氨基酸种类是（ ）。
A. 甘氨酸
B. 丙氨酸
C. 谷氨酸
D. 精氨酸
3、在液滴蒸发实验中，tick - GRP77 凝聚物形成的先后顺序是（ ）。
A. 液滴边界处蛋白质浓度增加→相边界形成→凝聚物出现
B. 相边界形成→液滴边界处蛋白质浓度增加→凝聚物出现
C. 凝聚物出现→液滴边界处蛋白质浓度增加→相边界形成
D. 液滴边界处蛋白质浓度增加→凝聚物出现→相边界形成
4、对于 tick - GRP77 的 LLPS 过程，以下哪种残基起主导作用？（ ）
A. 酸性残基
B. 碱性残基
C. 精氨酸和芳香族残基
D. 疏水残基
5、在添加的实验中，以下关于 tick - GRP77 凝聚的说法正确的是（ ）。
A. 低浓度的在短时间内就能使低浓度的 tick - GRP77 凝聚
B. 高浓度的在长时间孵育下才能使高浓度的 tick - GRP77 凝聚
C. 1M 存在时，较低浓度的 tick - GRP77 在短时间内可凝聚
D. 无论浓度如何，都不能使 tick - GRP77 立即凝聚
6、以下哪个实验结果最能表明 tick - GRP77 凝聚物发生了液 - 凝胶转变？（ ）
A. 凝聚物在高浓度下融合形成网络结构
B. FRAP 实验中老化样品荧光恢复率降低
C. 凝聚物在盐诱导下形成稳定簇
D. 力谱测量中凝聚物的粘附功较高
7、以下关于天然蜱唾液中蛋白质凝聚物的说法，错误的是（ ）。
A. 未吸血蜱唾液中也可能存在蛋白质凝聚物
B. 高盐浓度下唾液提取物中会出现纤维状结构
C. 提取的唾液腺内容物中蛋白质条带都对应 GRP
D. 显微镜观察到唾液提取物中有微米级球形液滴
8、以下哪项不是未来关于蜱 GRP 研究的方向？（ ）
A. 探究翻译后修饰对 GRP 的影响
B. 研究 GRP 在其他生物中的功能
C. 探索干扰 GRP 相变抑制水泥锥形成
D. 开发基于 GRP 的抗蜱疫苗载体
参考文献：
Ganar, K.A., et al. Phase separation and ageing of glycine-rich protein from tick adhesive. Nat. Chem. (2024).
