大家好呀！在微观的生物世界里“看”清各种细胞和生物现象，就像拥有了透视眼一样神奇！科学家们为了实现这个目标，想出了好多办法，其中生物发光成像技术超厉害！今天，咱们就一起来了解这种技术中生物发光颜色的神秘面纱——《Creating coveted bioluminescence colors for simultaneous multi-color bioimaging》发表于《SCIENCE ADVANCES》，看看科学家是怎么创造出超多颜色，实现同时观察好多生物目标的！

*本文只做阅读笔记分享*

一、研究背景：生物发光成像的那些事儿

细胞标记的重要性：在细胞的“小世界”里，要想追踪细胞的命运，观察细胞是怎么分类的，还有找到那些特别的稀有细胞，给细胞做标记就特别重要。光学标记，像荧光和生物发光，就经常被用来区分细胞，还有细胞里的各种小结构、蛋白质和生理物质呢。

生物发光的优势与挑战：荧光标记大家可能比较熟悉，用得也多。但生物发光也有它独特的优点！它是由荧光素在荧光素酶这些蛋白质的催化下发生化学反应产生的，不需要外界的激发光，这样就能避免自发荧光的干扰，检测起来信号特别强。

不过呢，它也有烦恼。比如说，生物发光的颜色种类不够多，现有的颜色变体不太够观察多个目标。而且在多色成像的时候，因为它的光谱比较宽，很容易“挤”在一起，不好分开，想要同时观察10种以上的生物发光颜色，在细胞层面还很难做到呢。

所以呀，科学家们就想办法啦！他们的目标就是开发一种新方法，能扩展生物发光的颜色，这样就能用生物发光更清楚地观察好多生物目标和现象啦。

二、研究内容：创造多彩的生物发光颜色

双受体BRET扩展颜色的原理：现在有一种很厉害的东西叫增强纳米灯笼（eNL），它有5种颜色变体。科学家们想，如果再给它融合一个荧光蛋白（FP），会怎么样呢？他们猜这样可能会引发另一种生物发光共振能量转移（BRET），让颜色变得更多。为了验证这个想法，他们把增强绿色荧光蛋白（eGFP）融合到CeNL的C末端，变成了CeNL-eGFP。

实验验证与结果：实验结果可有意思啦！用智能手机CMOS相机拍照对比，发现CeNL-eGFP的发光颜色和原来的CeNL不一样。再看看光谱，CeNL-eGFP多了一个峰值，原来的峰值还变小了呢。这说明双受体BRET真的能让eNL的光谱变得更丰富。基于这个原理，科学家们设计了好多eNL变体，把不同的FP融合到eNL的C末端。

在大肠杆菌里表达这些基因后，用智能手机相机就能看到它们发出不同颜色的光。把这些蛋白质提纯后，居然出现了20种不一样的颜色！这可比之前多多啦，科学家们把这个新的颜色系列叫做eNLEX（eNLexpansion），就像是给eNL的颜色家族来了一次大扩充。

颜色微调的方法：科学家们还发现，调整eNLEX的颜色还有小窍门呢！颜色的变化主要是因为多个光谱峰值波长和它们的比例不一样。

通过改变Nluc和FPs之间的距离，就能微调颜色的细微差别。比如说，用不同的链接器连接OeNL和FP，发现链接器真的会影响生物发光的颜色呢！这就好比调整两个小伙伴之间的距离，他们合作产生的效果就变啦。

三、多色成像应用：用多彩之光探索生物世界

细胞成像的奇妙之旅：有了这么多颜色的eNLEX，科学家们就开始用它给细胞做标记，进行多色成像啦！生物发光不需要激发光，用彩色CMOS相机就能同时检测和识别好多不同颜色的光。

科学家们准备了表达20种eNLEX颜色变体的HeLa细胞，用普通显微镜加上彩色CMOS相机去观察。哇，真的能看到细胞发出20种不同颜色的光呢！就算把这些细胞混合在一起培养，也能轻松区分它们的颜色。而且呀，在不同的细胞类型，像其他动物细胞和植物细胞里，eNLEX的颜色也能被清楚地区分出来

多尺度生物样本检测：eNLEX的本事可不止这些哦！它还能在不同尺度的生物样本里大显身手。科学家们把表达eNLEX不同颜色变体的HeLa细胞培养成细胞球，在细胞球里，每个细胞都有自己独特的发光颜色。

科学家们还把eNLEX和定位信号融合，让它跑到细胞里不同的小结构，像细胞核、线粒体这些地方，然后进行多色观察。结果发现，真的能清楚地看到这些细胞器，而且彩色CMOS相机的分辨率很高，连线粒体的分裂和融合这些细微的变化都能看到呢！

追踪细胞行为的魔法：用彩色CMOS相机进行生物发光成像的时候，还能记录细胞发光的波长信息呢。科学家们用这个方法追踪表达eNLEX不同颜色变体的细胞行为。他们选了一种合适的底物Piv-FMZ，观察细胞大概6个小时。通过把图像的RGB信息转换成HSV格式，就能根据发光颜色区分不同的细胞啦。而且，用另一种底物endurazine，还能更久地观察细胞的迁移和分化，信号强度也不会变弱哦。

监测生物指标的变化：eNLEX还能用来监测细胞里生物指标的变化呢。比如说，用它来追踪细胞内Ca2+的变化。有一种能检测Ca2+的生物发光传感器，叫ORCA-Y和ORCA-R。当Ca2+浓度变化的时候，它们的发光颜色会改变。科学家们用彩色相机观察，发现加入组胺刺激细胞后，细胞质和线粒体里的发光颜色真的变了，这就说明Ca2+浓度在细胞里发生了变化。

而且，eNLEX还能检测G蛋白偶联受体（GPCR）的活性呢。把GPCR和eNLEX结合起来，当GPCR和配体相互作用的时候，就能发出不同颜色的光，这样就能同时检测多个GPCR的活性啦！

四、研究总结：生物发光成像的现在与未来

本研究通过双受体BRET开发出含20种颜色的eNLEX，结合彩色CMOS相机实现多色生物成像，在多尺度生物样本检测中效果良好。不过，生物发光成像仍存在一些问题，如部分eNLEX成员受环境影响、多色成像时切换发射滤光片耗时等。未来可通过改进相机性能、选择合适底物等方式优化该技术。

五、一起来做做题吧

1、生物发光成像相比荧光成像的优势是？

A. 颜色种类更多

B. 无需激发光，避免自发荧光

C. 能实现更高分辨率成像

D. 成像技术更成熟

2、通过双-受体BRET扩展生物发光颜色的实验中，融合eGFP到CeNL的C端后，出现了什么现象？

A. 生物发光颜色无变化

B. 光谱出现额外峰值，原峰值强度增加

C. 光谱出现额外峰值，原峰值强度降低

D. 仅原峰值强度发生变化

3、关于 eNLEX 的说法错误的是？

A. 部分成员受环境条件影响

B. 可用于检测细胞内多种生物现象

C. 所有成员光谱都不受 pH 和温度影响

D. 能通过改变连接子调整颜色

参考文献：

Mitsuru Hattori et al. Creating coveted bioluminescence colors for simultaneous multi-color bioimaging. Sci. Adv.11, eadp4750(2025).