引言

神经退行性疾病的典型特征是随着年龄增长不同脑区的神经元进行性变性和丢失。额颞叶失智症（frontotemporal, FTD）主要表现为额颞叶神经元的萎缩和丢失，其临床表现为性格和行为的改变以及语言技能逐渐受损，是仅次于阿尔茨海默病（AD）的第二大痴呆症。与FTD不同的是，肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS, 俗称渐冻症）是由于下运动神经元及其轴突退化和上运动神经元及其皮质脊髓轴突束丧失（侧索硬化）导致肌肉萎缩和运动能力的丧失。尽管这两种神经退行性疾病致病区域和临床特征不一致，但是具有意想不到的共同病理特征和遗传病因。位于C9ORF72基因第一个内含子的六核苷酸GGGGCC重复序列过度扩增是导致FTD/ALS最常见的基因突变，占40%遗传性ALS，25%遗传性FTD, 以及7%散发性ALS和6%散发性FTD，这类由C9ORF72基因突变导致的FTD/ALS称为C9ORF72-FTD/ALS。

目前认为，GGGGCC重复突变主要导致两种获得性毒性，一是GGGGCC核苷酸重复序列转录后在细胞核内形成RNA聚集体 （RNA foci），螯合特定的RNA结合蛋白 (RBPs)，导致其功能紊乱；二是转运到细胞质中的GGGGCC RNA通过非AUG起始的蛋白翻译生成具有毒性的二肽重复蛋白 (DPR)，包括多聚甘氨酸丙氨酸（poly-GA），多聚甘氨酸脯氨酸（poly-GP）和多聚甘氨酸精氨酸（poly-GR）等。其中poly-GR表达最低但毒性最大。前期研究显示在FTD/ALS患者脑组织中存在大量的RNA可变剪接异常，外显子跳跃（exon skipping）和内含子保留（intron retention）事件在C9ORF72-FTD/ALS 患者脑组织中尤为突出，但是其分子机制并不清楚。

2024年8月23日，约翰斯霍普金斯大学医学院孙疏影团队在Neuron杂志在线发表题为 Disruption of nuclear speckle integrity dysregulates RNA splicing in C9ORF72-FTD/ALS的研究长文，发现在C9ORF72-FTD/ALS中，GGGGCC RNA foci和poly-GR通过不同途径协同破坏核斑（nuclear speckle）的功能完整性，导致RNA可变剪接异常和神经元退行性病变。

在这项研究中，研究人员首先将邻近标记和RNA标记技术结合，通过引入split-APEX系统，首次在活细胞中特异性标记(GGGGCC)n RNA结合蛋白。通过质谱准确鉴定(GGGGCC)n RNA原位结合蛋白，发现其结合蛋白参与RNA代谢各个过程。其中超过60%核斑组分与 (GGGGCC)n RNA潜在相互作用，提示 (GGGGCC)n RNA可能大部分定位于核斑。核斑是细胞核内负责前体信使RNA加工的无膜细胞颗粒，存储大量RNA加工相关蛋白，高度动态变化。研究人员进一步通过免疫荧光染色和RNA原位杂交，在报告基因细胞，病人iPSC来源的神经细胞中，均显示大部分 (GGGGCC)n RNA定位于核斑中，并导致核斑体积增大。核斑体积而不是数量的变化，可能是 (GGGGCC)n RNA 影响核斑组分的液液相分离特性。体外实验显示，(GGGGCC)n RNA可以诱导核斑核心蛋白SRRM2 IDR结构域由液滴向不可溶性的蛋白聚集体转变。通过CRISPR/Cas9敲入EGFP，内源性荧光标记活细胞中的核斑，FRAP实验显示，当(GGGGCC)n RNA表达时显著抑制核斑的动态特性。这些实验显示(GGGGCC)n RNA滞留于核斑中，影响其液液相分离和动态特性。然而，体外培养细胞中不存在DPR的聚集，不能完全模拟C9ORF72-FTD/ALS患者组织中的病理特征。研究人员通过改造AAV病毒载体并成功构建AAV-(GGGGCC)186小鼠模型。该小鼠模型完全展现了C9ORF72-FTD/ALS患者组织中的病理特征，如细胞核中聚集的 (GGGGCC)n RNA和细胞质中聚集的poly-GA, poly-GP和poly-GR。在该小鼠模型中，(GGGGCC)n RNA也主要定位于核斑中，意想不到的是部分细胞中核斑核心蛋白SRRM2错误定位到细胞质中形成聚集体。进一步发现错误定位的SRRM2主要与poly-GR共定位，少部分poly-GA和poly-GP聚体中存在SRRM2主要是由于这些聚集体中也存在poly-GR。在C9ORF72-FTD/ALS患者脑组织中也发现SRRM2错误定位，并且大部分与poly-GR共定位。而且核斑另一核心组分SON在C9ORF72-FTD/ALS患者组织中显著下调，表明在C9ORF72-FTD/ALS中核斑完整性显著损伤。但是，在散发性的FTD和ALS患者脑组织中并没有检测到明显的SRRM2异常定位和SON蛋白的下调，说明核斑异常是C9ORF72-FTD/ALS特有的病理机制。在iPSC来源的人神经元中敲低SRRM2和SON破坏核斑的完整性，导致广泛的RNA可变剪接改变，主要影响外显子跳跃和内含子保留事件。核斑调控的RNA剪接主要发生于携带短内含子及高GC含量的转录本中。核斑核心组分偏好结合高GC含量的转录本，可能是(GGGGCC)n RNA滞留于核斑的原因。核斑核心组分SRRM2和SON的丢失导致显著的神经细胞死亡，而过表达SRRM2可以部分挽回核斑功能紊乱导致的细胞死亡。总的来说， 这项研究利用iPSC来源的人神经细胞、动物模型和患者脑组织样品，首次发现在C9ORF72-FTD/ALS中，(GGGGCC)n RNA和poly-GR共同导致核斑功能紊乱的病理机制。一方面(GGGGCC)n RNA滞留在核斑中，抑制核斑的液液相分离和动态特性，影响RNA的准确加工；另一方面，细胞质中poly-GR和核斑核心蛋白SRRM2共聚集，破坏核斑完整性，加剧核斑的功能紊乱。核斑功能紊乱引起广泛的RNA剪接效率下降，导致外显子跳跃和内含子保留，引起神经细胞毒性。值得一提的是，在Tau相关疾病，如AD和FTD-TAU等神经退行性疾病中也存在核斑核心蛋白SRRM2的异常定位，提示靶向核斑为基础的治疗可能在多种神经退行性疾病中发挥作用。模式图（Credit: Neuron）

参考文献

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2024.07.025

责编|探索君

排版|探索君

文章来源|“BioArt”

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