顾建文教授、解放军总医院、第九医学中心、神经外科
摘要：单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）作为神经科学和神经外科研究领域的一项变革性技术，为我们深入理解复杂的神经系统疾病带来了前所未有的机遇。在脑肿瘤研究中，scRNA-seq 揭示了肿瘤的异质性、微环境、治疗抵抗机制以及侵袭模式，明确了脑三谱系癌症层次结构并弥补了现有模型的不足。对于阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病，scRNA-seq 实现了分子分型，确定了失调的通路并挖掘出潜在的治疗靶点。在癫痫领域，scRNA-seq 探索了其细胞和分子异质性，发现了独特的胶质细胞亚群以及免疫系统的失调。在脊髓疾病方面，scRNA-seq 刻画了不同的细胞成分及其对脊髓损伤的反应，提供了各类细胞的分子特征并明确了血管重塑中的相关相互作用。此外，scRNA-seq 还阐明了脑血管疾病（如中风）的分子复杂性，揭示了特定基因、细胞特异性表达模式及潜在的治疗干预措施。尽管 scRNA-seq 在数据分析、标准化、样本获取、可扩展性和成本效益等方面面临挑战，但其在指导精准医疗、识别临床生物标志物和推动治疗发现方面具有巨大潜力，有望变革神经科学和神经外科的临床实践，改善患者的治疗结局。
一、引言
神经系统疾病种类繁多且机制复杂，给医疗诊断和治疗带来了巨大挑战。传统的研究方法往往难以深入解析神经系统疾病在细胞和分子水平的变化。单细胞 RNA 测序技术的出现，为我们打开了一扇全新的窗口，能够从单个细胞的分辨率去探索神经系统疾病的奥秘，这对于深入理解疾病的发病机制、开发精准有效的治疗策略具有至关重要的意义。
二、单细胞 RNA 测序技术概述
（一）技术原理单细胞 RNA 测序是一种能够在单个细胞水平上对转录组进行高通量测序分析的技术。它通过对单个细胞中的 RNA 进行提取、反转录、扩增和测序，获取每个细胞的基因表达谱。其核心原理在于能够区分不同细胞间基因表达的差异，从而揭示细胞的异质性。
（二）技术流程
样本准备首先需要从组织或细胞悬液中分离出单个细胞。这可以通过多种方法实现，如流式细胞术、激光捕获显微切割等技术，确保获得高质量的单个细胞用于后续分析。RNA 提取与反转录从单个细胞中提取 RNA，并将其反转录为互补 DNA（cDNA）。这一步骤需要高度的精确性，以保证 RNA 的完整性和反转录的效率。文库构建与测序构建 cDNA 文库，然后利用高通量测序平台进行测序。目前常用的测序平台包括 Illumina、PacBio 等，它们能够提供大规模、高深度的测序数据。数据分析测序得到的数据量庞大且复杂，需要进行专业的生物信息学分析。包括数据的质量控制、基因表达定量、细胞聚类分析、差异基因表达分析等，以提取有价值的生物学信息。（三）技术优势与局限性
优势高分辨率：能够揭示单个细胞间的基因表达差异，发现以往被掩盖的细胞亚群和异质性。全面性：可以同时分析数千个基因的表达情况，提供丰富的分子信息。动态监测：有助于研究细胞在不同生理和病理状态下的基因表达变化。局限性技术复杂：对实验操作和数据分析的要求较高，需要专业的技术人员和强大的计算资源。样本要求高：需要高质量的单细胞样本，样本处理过程中可能会引入偏差。数据分析挑战：海量数据的分析和解读难度较大，容易出现假阳性和假阴性结果。
三、单细胞 RNA 测序在神经系统疾病研究中的应用
（一）脑肿瘤研究
揭示肿瘤异质性脑肿瘤是高度异质的，不同肿瘤细胞在基因表达、增殖能力、侵袭性等方面存在显著差异。scRNA-seq 能够识别出肿瘤组织中的不同细胞亚群，包括肿瘤细胞、免疫细胞、血管内皮细胞等，以及它们各自的基因表达特征。例如，在胶质母细胞瘤中，通过 scRNA-seq 发现了具有不同分子标记和功能特性的肿瘤细胞亚群，这有助于更精准地理解肿瘤的生物学行为和制定个性化的治疗方案。解析肿瘤微环境肿瘤微环境对肿瘤的生长、侵袭和治疗反应起着关键作用。scRNA-seq 可以详细描绘肿瘤微环境中的细胞组成和相互作用。研究发现，肿瘤相关巨噬细胞在脑肿瘤微环境中具有多种功能状态，其与肿瘤细胞之间存在复杂的相互作用，影响肿瘤的进展和治疗抵抗。探索治疗抵抗机制治疗抵抗是脑肿瘤治疗中的一个重大难题。scRNA-seq 有助于揭示肿瘤细胞在治疗过程中发生的基因表达变化，从而找出导致治疗抵抗的潜在分子机制。例如，一些研究发现某些脑肿瘤细胞在放疗或化疗后，通过上调特定的基因表达来逃避治疗的杀伤作用，这为开发新的治疗策略提供了靶点。明确肿瘤侵袭模式脑肿瘤的侵袭性生长是影响患者预后的重要因素。scRNA-seq 能够追踪肿瘤细胞在侵袭过程中的基因表达变化，发现与肿瘤侵袭相关的基因和信号通路。例如，某些基因的表达上调可能促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，这为开发抑制肿瘤侵袭的药物提供了线索。（二）神经退行性疾病研究
分子分型阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病在临床表现和病理特征上存在一定的异质性。scRNA-seq 可以根据基因表达模式对这些疾病进行更精确的分子分型。例如，在阿尔茨海默病中，scRNA-seq 发现了不同脑区的神经元在疾病进展过程中具有不同的基因表达变化，这有助于早期诊断和病情监测。失调通路鉴定通过比较疾病状态和正常状态下细胞的基因表达谱，scRNA-seq 能够鉴定出在神经退行性疾病中失调的信号通路。例如，在帕金森病中，发现线粒体功能相关通路和炎症相关通路的基因表达异常，这为深入理解疾病的发病机制提供了重要依据。潜在治疗靶点挖掘基于对失调通路和基因表达变化的分析，scRNA-seq 为神经退行性疾病的治疗提供了潜在的靶点。例如，针对阿尔茨海默病中 β- 淀粉样蛋白代谢相关基因的异常表达，开发相应的药物或基因治疗策略，有望延缓或阻止疾病的进展。（三）癫痫研究
细胞和分子异质性探索癫痫的发病机制复杂，涉及多种细胞类型和分子机制。scRNA-seq 可以揭示癫痫患者脑组织中不同细胞类型（如神经元、胶质细胞等）的基因表达异质性。研究发现，癫痫患者大脑中的某些胶质细胞亚群在基因表达上与正常胶质细胞存在显著差异，可能参与了癫痫的发病过程。免疫失调研究越来越多的证据表明，免疫系统在癫痫的发生发展中起着重要作用。scRNA-seq 能够分析癫痫患者脑组织中免疫细胞的状态和功能变化。例如，发现某些免疫细胞亚群的活化和炎症因子的释放与癫痫发作密切相关，这为开发免疫调节治疗策略提供了理论基础。（四）脊髓疾病研究
细胞成分刻画脊髓疾病（如脊髓损伤、脊髓肿瘤等）会导致脊髓组织中细胞成分的改变。scRNA-seq 可以精确刻画脊髓疾病状态下不同细胞类型的变化，包括神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等。例如，在脊髓损伤后，scRNA-seq 发现胶质细胞的反应性增生和功能改变，以及神经元的损伤和修复相关基因表达变化。血管重塑研究脊髓疾病常伴随着血管结构和功能的改变，影响脊髓的血液供应和修复过程。scRNA-seq 能够揭示血管内皮细胞和周细胞在疾病过程中的分子变化，以及它们与其他细胞类型之间的相互作用，为促进脊髓血管重塑和神经功能恢复提供了研究方向。（五）脑血管疾病研究
中风分子机制解析中风是一种常见的脑血管疾病，具有复杂的病理生理过程。scRNA-seq 可以分析中风患者脑组织中不同细胞在急性期和恢复期的基因表达变化，揭示与神经元损伤、炎症反应、血管修复等相关的分子机制。例如，发现某些基因在中风后早期的表达变化与神经元的凋亡和炎症细胞的浸润密切相关。潜在治疗干预靶点发现基于对中风分子机制的深入理解，scRNA-seq 有助于发现潜在的治疗干预靶点。例如，针对中风后炎症反应相关的细胞因子或信号通路，开发相应的抗炎药物或生物制剂，可能改善中风患者的预后。四、单细胞 RNA 测序面临的挑战与展望
（一）挑战
数据分析挑战scRNA-seq 产生的数据量巨大且复杂，需要强大的生物信息学工具和专业的数据分析人员进行处理和解读。目前的数据处理方法仍在不断发展和完善中，如何准确地从海量数据中提取有生物学意义的信息，减少假阳性和假阴性结果，是当前面临的一个重要挑战。标准化问题不同实验室和研究团队在 scRNA-seq 实验流程和数据分析方法上存在差异，导致研究结果难以直接比较和整合。建立统一的标准化操作流程和数据分析标准，对于推动 scRNA-seq 技术的广泛应用和研究成果的交流合作至关重要。样本获取困难获取高质量的单细胞样本对于 scRNA-seq 研究至关重要。在神经系统疾病研究中，某些疾病组织（如脑肿瘤组织、神经退行性疾病患者的脑组织等）的获取存在一定难度，且样本处理过程中需要保持细胞的活性和完整性，这对样本采集和处理技术提出了更高的要求。可扩展性和成本效益随着 scRNA-seq 技术的广泛应用，如何提高其可扩展性，降低成本，使其能够在临床实践中得到更广泛的应用，是需要解决的现实问题。目前，scRNA-seq 技术的成本仍然较高，限制了其在大规模临床研究中的应用。（二）展望尽管面临诸多挑战，但 scRNA-seq 技术在神经系统疾病研究中的前景依然十分广阔。随着技术的不断发展和完善，未来有望实现以下目标：
精准医疗的推动scRNA-seq 将为神经系统疾病的精准医疗提供更强大的支持。通过对患者个体细胞水平的分子信息分析，实现疾病的早期诊断、个性化治疗方案的制定以及治疗效果的精准监测。新治疗靶点和药物的发现深入揭示神经系统疾病的分子机制，将有助于发现更多新的治疗靶点，开发出更有效的治疗药物。例如，针对特定细胞亚群或信号通路的小分子抑制剂、基因治疗药物等。多组学整合研究将 scRNA-seq 与其他组学技术（如蛋白质组学、代谢组学等）相结合，实现对神经系统疾病更全面、深入的理解。从基因表达、蛋白质功能和代谢变化等多个层面揭示疾病的发生发展机制，为治疗策略的制定提供更丰富的信息。临床转化应用随着技术的成熟和成本的降低，scRNA-seq 有望逐渐应用于临床实践。例如，作为一种辅助诊断工具，帮助医生更准确地诊断神经系统疾病、评估疾病预后以及监测治疗反应。五、结论
单细胞 RNA 测序技术作为神经科学和神经外科研究领域的一项强大工具，为我们深入理解神经系统疾病的分子景观提供了前所未有的机会。通过对脑肿瘤、神经退行性疾病、癫痫、脊髓疾病和脑血管疾病等多种神经系统疾病的研究，scRNA-seq 在揭示疾病的细胞和分子异质性、发病机制、治疗抵抗机制以及潜在治疗靶点等方面取得了显著成果。尽管目前仍面临数据分析、标准化、样本获取、可扩展性和成本效益等诸多挑战，但随着技术的不断发展和改进，scRNA-seq 有望在未来推动神经系统疾病的精准医疗，为改善患者的预后带来新的希望。继续加强对 scRNA-seq 技术的研究和应用，将有助于我们在神经系统疾病的研究和治疗领域取得更大的突破。
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