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脂质纳米颗粒（LNPs）已成为一种强大的RNA递送平台，如何通过LNPs将RNA有效递送到细胞膜至关重要。一种具有较好前景的策略是使用带正电荷的脂质，这种脂质能可以提高LNPs的稳定性和递送效率。但是由此产生的强静电相互作用降低脂质体释放RNA的能力。近日，来自湖南大学的吴振坤教授团队进行了工程化细胞选择性电荷可变脂质纳米颗粒实现体内高效siRNA递送的相关研究。研究成果以“Engineering Cell-Selective Charge-Altering Lipid Nanoparticles for Efficient siRNA Delivery in Vivo”为题于01月24日发表在《CCS Chemistry》上。
本文设计了一种过氧化氢（H2O2）触发的表面电荷可变LNP（CALNP），用于高效递送小干扰RNA（siRNA）并抑制肿瘤生长。将苯硼酸（PBA）加入可离子化的脂质中可生成永久带正电荷的脂质。通过静电和配体-受体结合双重作用，确定一种具有最佳脂质体配方的CALNP，能显著提高转染效率，有效进行溶酶体逃逸。在生理pH值下H2O2触发后PBA基团去除实现正电荷减少，从而实现siRNA在细胞质中选择性释放。结果表明，CALNPs提高siRNA的转染和基因沉默效率。CALNP对Plk1基因较强活性，能有效沉默Plk1 mRNA，进而抑制肿瘤生长。总之，CALNP作为一种高效RNA递送平台，为肿瘤调理提供一项新策略。
本文从以下几个方面进行详细描述
1. LNP设计和表征
2. 评估细胞中递送siRNA的CALNP
3. 在肿瘤细胞中实现高效基因沉默
4. CALNP体内调理效果分析
图1 细胞选择性CALNP在体内高效递送siRNA和调理肿瘤示意图
LNPs正电荷在通过静电作用或质子海绵效应促进RNA凝聚、细胞内化和溶酶体逃逸方面具有重要作用。本文开发了一种电荷可变LNP（CALNP），其中可电离的脂质体含有永久性的正电荷，并在刺激触发消除反应中再生iLNP，从而使生理pH值下正电荷显著减少，有效在细胞质中释放siRNA。该永久正电荷脂质体是用PBA修饰叔铵盐头基生成季铵盐头基合成的，提供一种对pH值不敏感的阳离子电荷，能在各种酸和碱性环境中与siRNA发生强烈静电作用。由此产生的高正电荷LNP具有最佳脂质体配方，能有效将siRNA递送入细胞并从溶酶体中逸出。此外，PBA与肿瘤细胞上过度表达硅酸（SA）之间的界面相互作用，进一步促进细胞内化。渗入肿瘤细胞后，在内源性H2O2触发下与PBA反应生成苯酚衍生物，生成的iLNP在生理pH值下的正电荷显著减少，降低CALNP的稳定性，将siRNA释放到细胞质中。研究结果表明，工程化CALNP通过电子相互作用和配体-受体结合双重效应提高siRNA的内化效率，并有效逃逸溶酶体。CALNP封装了靶向Plk1基因iRNA，可诱导高效基因沉默抑制肿瘤生长。总之，以上结果表明CALNP可作为一种高效的siRNA递送平台通过基因沉默用于癌症调理。
图2 优化和表征CALNPs
为证明脂质体电荷可变特性，研究人员设计并合成两种新型季铵盐脂质体，即CA和nCA脂质体。提供永久正电荷的CA能与H2O2发生反应，通过消去反应生成可离子化脂质体（离子脂）。nCA脂质体带有非反应性正电荷。使用1H NMR和ESI-MS对脂质体进行表征，使用动态光散射（DLS）测量LNPs粒径和zeta电位。结果显示，平均直径从188纳米减小到76纳米，而zeta电位从-16mV上升到+36mV。为评估LNP的siRNA递送效果，将一种近红外（NIR）荧光团Cy5标记的siRNA合成并封装在LNP中进行荧光检测。结果表明，将LNPs中CA脂质体比例从0%提高到50%，可提高siRNA的递送效率。表明表面正电荷的增加有利于siRNA的负载和细胞内化。然而，当LNPs中CA脂质体的比例从50%进一步增加到100%时，递送效率降低了，可能是由于细胞摄取效率或siRNA负载能力降低所致。接着对基因沉默效果进行分析，结果表明用含50%CA-脂质的LNP处理的细胞具有最高沉默效果。接着研究人员对CALNPs的拓扑结构和理化性质进行了表征。电泳分析显示，在N/P比为2或更高时，CALNPs能有效负载siRNA。TEM显示CALNP呈球形。DLS分析表明，CALNP流体力学直径为100纳米，且在24小时内保持不变。然后，研究人员分析了H2O2触发的PBA基团去除是否能显著降低生理pH值下的正电荷。结果表明，在H2O2诱导下，CALNP转化为pKa为6.1的iLNP，显著降低正电荷。
图3 CALNPs基因沉默和抗肿瘤能力
过量产生的H2O2与包括癌症在内的各种疾病密切相关，使其有望成为激活肿瘤调理药物的刺激物。为明确H2O2触发LNP电荷改变在高效释放siRNA和基因沉默方面的有效性，对不同化学型LNP的沉默活性进行分析。尽管nCALNP比iLNP具有更高的转录效力，但iLNP具有更高的基因沉默效率。以上结果表明，带永久正电荷的LNP与siRNA形成稳定的复合物，导致siRNA在细胞质中释放的解离效率较低。流式细胞分析显示，转染CALNPs的MCF-7细胞的基因沉默效率为96%，而转染了nCALNP和iLNP的细胞的沉默效率分别为44%和84%。综上所述，结果表明CALNP是一种高效的基因沉默平台。接着本文探讨了CALNP是否能对过量产生的H2O2作出反应，从而实现肿瘤细胞选择性基因沉默。选择细胞内H2O2浓度较高的人类乳腺肿瘤细胞MCF-7和细胞内H2O2浓度较低的正常人类胚胎肾细胞HEK-293T作为模型细胞系。结果显示，H2O2触发siRNA的高效释放，从而有效沉默肿瘤细胞中的基因。为了直接评估其基因沉默能力，使用RT-PCR测定了Plk1 mRNA的相对表达水平。与空白细胞相比，转染了NC@CALNP细胞的mRNA水平保持不变。用CALNP处理的细胞显示出显著的基因沉默效率，达到60%，远高于Lipo2000和 LNP。综上所述，以上数据表明CALPNs能有效抑制Plk1 mRNA的基因表达，在癌症调理方面具有较大潜力。
图4 CALNP在体内生物分布和抗肿瘤能力
为评估CALNP在体内的生物分布和肿瘤蓄积情况，对携带MCF-7异种移植瘤的裸鼠静脉注射Cy5标记的siRNA@CALNP。注射后30分钟，在肝脏和肾脏两个代谢器官以及MCF-7肿瘤中发现强烈荧光信号，在MCF-7肿瘤中至少持续6天。解剖肿瘤和主要器官的体外荧光成像也显示，注射后第1天，CALNP在肿瘤中的蓄积量更高，与非侵袭性成像结果一致。CALNP在肿瘤中的高蓄积能力表明其能在体内高效递送siRNA和抗肿瘤。接着本文评估了CALNP对携带MCF-7异种移植肿瘤小鼠的调理效果。CALNPs经尾静脉注射后，结果显示接受PBS或NC@CALNP调理的小鼠肿瘤体积显著增大。注射CALNPs可显著抑制肿瘤生长，其效果明显优于注射iLNPs的小鼠。肿瘤重量测量进一步验证CALNPs对肿瘤生长的抑制作用。此外，在整个调理过程中，小鼠体重几乎无变化，表明给药的CALNP毒性极低。H&E染色也表明，与接受PBS或NC@CALNP调理的小鼠相比，接受CALNPs调理的小鼠肿瘤细胞密度明显降低，显示出比接受NC@CALNP或iLNPs调理的小鼠更有效的抗肿瘤活性，这一趋势与TUNEL检测结果一致。综上所述，以上结果表明CALNP是一种有效、安全的体内siRNA递送平台，可用于基因沉默和肿瘤调理。
总结与展望
本文开发了一种H2O2触发的CALNP，用于体内高效siRNA递送和基因沉默。CALNPs是通过在可离子化脂质体的叔铵头基团中加入PBA基，从而形成一种永久带正电的脂质体。活细胞研究表明，由于静电和PBA受体结合双重相互作用，CALNPs具有更好的细胞内化和溶酶体逃逸效率。转染到MCF-7乳腺癌细胞和HEK-293T正常肾脏细胞后，肿瘤细胞中过量产生的H2O2触发PBA基团去除，并经过1,6-消除作用生成iLNP，在生理pH值下正电荷减少，从而使siRNA在细胞质中释放，以敲除外源EGFP mRNA。进一步利用CALNPs有效递送siRNA，在体外细胞培养和体内异种移植小鼠模型中靶向内源性Plk1基因进行肿瘤调理，结果显示基因沉默效率提高，肿瘤生长受到极大抑制。未来CALNPs可为体内siRNA递送和肿瘤调理提供全新的策略。
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