诊室内，一对备孕夫妻前来问诊。妻子：「医生，我们结婚很多年了，一直没要上孩子，最近准备进入试管周期。但年龄比较大，想在怀孕前把我们妻双方的遗传病查一查，省去以后不必要的麻烦。」医生：「能有优生意识非常正确，一些遗传性疾病很难彻底治愈，但是却可提前预防，比如脊髓性肌萎缩症（SMA）。目前，SMA 位居 2 岁以下儿童致死性遗传病首位，我建议可以做下筛查」。

SMA 疾病特点与诊断

从临床表现方面，SMA 由重到轻分为 4 型，1 型婴儿型，2 型中间型，3 型青少年型，4 型成人型。其中，1 型婴儿型是 SMA 的主要类型，占全部病例的 45%[1]。患者常在出生后 6 个月内起病，预后差，多数患儿在 2 岁内死于呼吸衰竭。在临床诊治过程中，对于疑似 SMA 的患者需重点关注、仔细询问相关病史及临床表现，完善相关检查，明确诊断，具体可参考以下诊断流程[1]：

图 1 SMA 诊断流程图

从诊断流程图中可以看到，SMN1 基因是 SMA 最为关键的致病基因，其致病性突变可引起编码的运动神经元存活蛋白表达水平下降或功能丧失。因此，检测 SMN1 致病性突变对确诊 SMA 至关重要。此外，与 SMN1 高度同源的 SMN2 基因是 SMA 的修饰基因，其拷贝数与 SMA 表型严重程度呈负相关。因此，检测 SMN2 基因有助于 SMA 患者的临床分型、治疗方案选择及预后评估。

因 SMA 致病基因人群携带率高，预后差，治疗手段有限且成本高，在门诊工作中，筛选 SMA 致病基因携带的育龄未孕女性、孕期筛查 SMA 受累胎儿及对 SMA 患儿应检尽检，尽早确诊，做好三级预防至关重要。目前，像本文病例中的 SMA 遗传咨询、以及后期胚胎着床前遗传学检测、产前诊断、SMA 新生儿筛查均已写入相关专家共识，用以指导临床实践。

SMN1 基因常用检测方法[2-3]

在临床中，实现 SMA 致病基因精准检测一方面依赖检测技术本身的敏感度和特异度，另一方面，规范的操作流程与相关检测产品的质控也不容轻视。目前，SMN1 基因常用的检测技术主要包括限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）、实时荧光定量 PCR 及多重连接探针扩增技术（MLPA），不同的检测技术特点不同，可总结为下表。

表 1 SMN1 基因检测常用检测方法总结表[2-3]

除上述常用检测技术之外，其他不常规使用的检测技术还包括 Sanger 测序、二代测序技术（NGS）、双侧双重等位基因特异性 PCR（AS-PCR）、聚合酶链反应-变性高效液相色谱（PCR-DHPLC）等。

通常来讲，MLPA 虽然是国内外 SMA 管理共识推荐使用诊断 SMA 的金标准，但该方法操作繁琐，需要一代测序仪，设备成本高，且目前没有 NMPA 审批的试剂盒。相比之下，定量 PCR（qPCR）法具有准确性高、稳定性好等特点。目前，该方法已有 NMPA 审批的商品化 SMN1 基因缺失检测试剂盒，避免了程序优化及试剂选择中可能引入的结果差异，成为临床上 SMA 诊断的主要辅助手段[3-4]。

PCR-熔解曲线法基于荧光定量 PCR，并做进一步改良，结合了竞争性 PCR、饱和荧光染料、熔解曲线分析技术及归一化软件处理技术，用于 DNA 样本中 SMN1 基因的拷贝数检测，拥有高灵敏度及特异度。需注意的是，虽然该方法简便、易操作，在检测过程中，为保证检测结果准确可靠，还是需要注意规范操作，同时，检测产品质量把控也是不容忽视的一环。

PCR-熔解曲线法检测流程、注意事项以及质控管理

目前，PCR-熔解曲线检测致病基因 SMN1 依赖于成熟的基因检测试剂盒来完成，为了确保检测准确性，在实操过程中的检测流程及注意事项如下（以天隆科技 SMA 试剂盒为例）：

① 标本采集：常用的标本包括乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血（2～5 mL）。

※ 注意全血样本在 2 ℃～8 ℃ 条件下保存时间不超过 4 天，-20 ℃ 或以下条件可保存 12 个月，避免反复冻融；

② 核酸提取：建议使用核酸提取仪及配套试剂进行自动化核酸提取，并按照说明书规范进行核酸提取。

※ 注意：全血样本勿吸取凝血块或粘稠状液体；吸取洗脱产物时如果观察到有粘稠液或明显磁珠残留，可采用高速离心后取上清液检测；样本提取 DNA 需用紫外分光光度计测定浓度，DNA 质量符合相关要求（浓度：10～120 ng/μL，纯度（OD260/OD280）：1.7～2.0。

③ PCR 扩增及荧光检测：参照相关说明书进行试剂配制及分装、体系建立，以及后续 PCR 扩增及荧光检测。

④ 数据分析及结果判断

※ 注意：数据读取前首先进行检测有效性评估，主要包括：① 质控，即评估 0 拷贝质控品和单拷贝质控品熔解曲线峰及 R 值；② 样品有效性，即评估样品浓度、纯度、△Tm 值及扩增曲线。在确定检测有效性后进行结果判定：若 SMN1 基因检测 7 号及 8 号外显子检测均为 2 拷贝及以上（R ≥ 0.74），则未发现 SMN1 基因缺失，若检测未 0 拷贝（P = 0）或单拷贝（R ≤ 0.70），则考虑为 SMN1 纯合缺失/杂合缺失，若 0.70 < R < 0.74，建议重新取样进行检测，或使用其他检测技术进行检测。

⑤ 试验后处理：包括废弃物、样本以及试剂材料处理、紫外消毒等。

PCR-熔解曲线法检测流程图

由于检测结果直接指导临床实践，检测过程中的质控非常关键，在应用 SMN1 检测试剂盒时，我们也应当关注试剂产品质控是否达到了相关要求，以天隆科技生产质控为例，具体有以下几方面：

质量管理：试剂生产采用科学的质量管理方法，包括统计过程控制、测量系统分析等，以确保检测过程持续可控。试剂在已通过 ISO 9001、ISO 及 TUV 13485 质量体系考核的 GMP 车间生产，严格执行三检要求，即自检、互检、专检。

参考品：所用试剂盒是否设有真实样本配制的参考品（阴性参考品、阳性参考品、精密度参考品、检测限参考品等），以确保产品安全有效的同时，更加符合临床真实检验场景；检测限参考品包含：0 拷贝、单拷贝、两拷贝，有效保证产品检测的灵敏度，并准确识别纯和缺失和杂合缺失。

目前，SMA 致病基因 SMN1 检测已被多项共识推荐用于该病的诊断及三级预防。其中，qPCR 检测技术因多项优点成为 SMA 诊断的主要辅助手段，此技术及基于此的改良技术研发的检测试剂盒已广泛应用于临床。在检测过程中，应熟悉检测流程同时做好质控，以保证检测的灵敏度及准确度。