大家好！今天来了解一项关于拉曼显微镜技术的研究——《Raman microscopy of cryofixed biological specimens for high-resolution and high-sensitivity chemical imaging》发表于《SCIENCE ADVANCES》，该技术通过冷冻固定生物标本，实现了高分辨率和高灵敏度的化学成像。这一研究成果在生物医学领域具有重要意义，为我们深入了解生物分子的分布和变化提供了有力工具。
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一、研究背景
拉曼显微镜在生物标本分子分析中具有重要地位，但由于拉曼散射截面小，其信噪比受到严重限制。传统方法如高强度激光照射会损伤标本，低强度激光则需长采集时间，易产生运动伪影和生理变化；化学试剂固定虽能抑制标本运动，但会导致细胞变性，且对某些分子固定效果不佳。
二、倒置拉曼显微镜与定制低温恒温器制备
开发了一种倒置拉曼显微镜，配备了定制的低温恒温器。该恒温器能够实现样本的快速冷冻和低温观察，为后续的高质量成像奠定了基础。
样本放置在熔融石英盖玻片上，位于样品架中，与冷却块之间由20μm高的不锈钢垫片隔开，这样可以有效防止细胞因直接接触冷却块而受损。冷却块配备了热电偶、液氮循环通道和加热器，用于精确控制样本温度。在冷却和观察过程中，恒温器内的氮气流动可防止样本周围结霜。
三、冷冻固定与低温测量的优势
（一）提高信噪比和分辨率
冷冻固定细胞在750cm⁻¹（细胞色素的卟啉呼吸）、1680cm⁻¹（蛋白质的酰胺I）和2850cm⁻¹（脂质的对称CH₂拉伸）处的拉曼图像与活细胞具有相似的对比度。
虽然观察区域的拉曼光谱中出现了冰晶峰，但在冷冻固定细胞的拉曼图像中未观察到细胞体和细胞器的破坏。
通过比较低温（233K）和室温（293K）下活细胞的拉曼图像和光谱，我们发现许多细胞拉曼带在两种温度下相似，但部分脂质相关的拉曼峰（如1061和2880cm⁻¹）在冷冻固定细胞和活细胞中存在差异，这归因于低温下脂质相的变化。
在光谱分辨率方面，以苯丙氨酸在1001cm⁻¹处的苯环呼吸模式为例，低温测量（采用高波长色散和窄入口狭缝）时带宽为4.4cm⁻¹，而室温活细胞拉曼测量（低波长色散和宽入口狭缝）时带宽为7.3cm⁻¹，表明低温测量可显著提高光谱分辨率。
（二）减少光损伤和运动伪影
1、模拟与实验验证
通过模拟和实验研究了拉曼观察中激光照射引起的局部加热情况。假设黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和还原型细胞色素c为主要吸收体，测量其吸光度和细胞内浓度用于模拟。模拟结果显示，在我们实验所用的激光线照射70秒后，温度升高约1-2K，且在约5秒内达到稳态。
实验中，通过测量约3130cm⁻¹处的温度依赖性O─H伸缩带（可用于监测样本温度），发现低温测量期间（如HeLa细胞在233K下，激光照射5秒和40秒/线时）拉曼带几乎相同，且峰值位置与233K的纯水相似，证实了低温测量时无明显温度升高，减少了光损伤。
（三）保留细胞生理状态
1、细胞内分子观察实验
与化学固定（如PFA固定）相比，冷冻固定在保留细胞生理状态方面具有明显优势。例如，在观察细胞内细胞色素和炔基标记的辅酶Q（AltQ2）时，PFA固定的细胞由于细胞色素氧化和AltQ2空间改变，其拉曼信号降低，而冷冻固定细胞的分布与活细胞相似。
2、心肌组织研究
在心肌缺血研究中，我们对大鼠心肌组织进行快速冷冻和低温拉曼成像。结果显示，在停止Langendorff灌注含氧Tyrode’s溶液1分钟和21分钟后冷冻的心脏组织中，通过拉曼图像重建和光谱分析，发现缺血21分钟时心肌细胞内还原型细胞色素c的信号强度高于1分钟时，与单点时间分辨拉曼光谱结果一致，且氧合肌红蛋白的拉曼带（1640cm⁻¹）与还原型细胞色素c信号呈相反趋势，表明快速冷冻成功保留了心肌细胞中细胞色素c的氧化还原状态。
四、应用实例
（一）HeLa细胞多色拉曼成像
1、多标记成像结果
对冷冻固定的HeLa细胞进行了高信噪比和多色拉曼成像。除了观察到细胞内未标记的细胞色素、DNA/RNA、类胡萝卜素、脂质和蛋白质的拉曼图像外，还同时观察到了三种拉曼标记物（EdU、MitoBADY和AltQ2）。此外，利用冷冻保存细胞内外水分布的拉曼信号，我们还获得了细胞内外水分布的拉曼图像，这有助于理解冷冻保存细胞的状态。
（二）大鼠心肌组织缺血研究
1、氧化还原状态成像
通过对大鼠心肌组织在缺血和非缺血情况下的快速冷冻和低温拉曼成像，我们成功实现了对急性缺血心脏的氧化还原成像。这一技术不仅能够获取拉曼光谱，还能在保留生化反应的同时获得拉曼图像，为研究心肌缺血等疾病提供了重要的手段。
五、研究结论与展望
本研究开发的冷冻固定生物标本的拉曼显微镜技术，通过结合冷冻固定和低温测量，克服了传统拉曼显微镜在信噪比、分辨率、光损伤和运动伪影等方面的局限性。该技术能够在保留细胞生理状态的同时，实现对生物分子的高分辨率和高灵敏度化学成像，为生物医学研究提供了强大的工具。未来，进一步提高检测灵敏度将有助于拓展该技术在药物成像、细菌检测等领域的应用，并且有望与其他成像技术相结合，为生物样品的分析提供更深入、全面的信息。
六、一起来做做题吧
1、拉曼显微镜在生物标本测量中，以下哪个因素限制了其信噪比？（ ）
A. 激光强度过高
B. 拉曼散射截面小
C. 样本固定方法不当
D. 光谱分辨率低
2、在样本制备过程中，HeLa 细胞培养时使用的培养基在拉曼测量前需要更换为（ ）。
A. DMEM 溶液
B. FBS 溶液
C. HBSS 溶液
D. 青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺溶液
3、与化学固定相比，冷冻固定的优势不包括以下哪项？（ ）
A. 更好地保留细胞分子分布
B. 减少光损伤
C. 避免冰晶形成
D. 保留细胞生理状态
4、在对大鼠心肌组织的研究中，快速冷冻和低温拉曼成像主要用于观察（ ）。
A. 心肌细胞的结构
B. 细胞色素 c 的氧化还原状态
C. 脂质的分布
D. 蛋白质的表达
参考文献：
Kenta Mizushima et al. Raman microscopy of cryofixed biological specimens for high-resolution and high-sensitivity chemical imaging. Sci. Adv.10, eadn0110(2024).
