导语

自上个世纪七十年代第一代Sanger测序技术问世以来，经历了多代测序技术的变革。尽管一代测序作为测序黄金标准，但其数据产出低通量性制约了基因组学的快速发展。因此，新一代测序技术（Next generation sequencing，NGS）应运而生，革命性的提高了测序通量和时效性，推动了多组学研究的大众化。目前主流的二代测序技术是Illumina（因美纳）技术（https://www.illumina.com.cn/）和DNBSEQ（华大智造）技术（https://www.mgi-tech.com/）。那么这两种技术之间究竟什么样的区别呢？我们今天将从多个方面进行深度剖析他们之间的差异~~

测序原理ORIGINGENE

结合Illumina和BGI官方发布的测序原理来看，二者在文库制备、文库扩增以及测序阶段都有差别。让我们来逐一学习并分析~~

（1）文库构建

1）Illumina文库构建步骤

A. DNA片段化：

使用机械（如声波破碎）或酶法（如限制性内切酶）将基因组DNA片段化。

B. 末端修复和加A尾：

片段化的DNA末端需要进行末端修复以生成平末端，然后添加A尾形成粘性末端以便于接下来接头的连接。

C. 接头连接：

将含有测序引物和条形码序列（用于样本多重化）的接头连接到片段化的DNA上。

D. PCR扩增：

对连接接头的DNA片段进行PCR扩增，以获得足够量的DNA文库，同时引入测序所需的序列。

E. 文库质控和定量：

使用Qubit、Bioanalyzer等工具对文库进行质控和定量，以确保文库质量和浓度符合测序要求。

Illumina官网

2）BGI文库构建步骤

A. DNA片段化：

与Illumina相似，BGI也使用机械或酶法将基因组DNA片段化。

B. 末端修复和接头连接：

片段化的DNA进行末端修复，然后直接连接特定的Bubble接头，这些接头包含测序引物和条形码序列。

C. PCR扩增

对连接接头的DNA片段进行PCR扩增，以获得足够量的DNA文库。

D. 文库质控和定量：

使用类似的方法对文库进行质控和定量，以确保文库质量和浓度符合测序要求。

华大智造官网

从上述的文库构建来看，不难看出，BGI和Illumina平台在建库阶段最大的区别在末端修复和接头连接时的不同。主要区别在以下三个方面：

1）Illumina文库接头是完全双链的DNA分子，具有已知序列，可以与目标DNA片段通过连接酶反应进行连接；而BGI的Bubble接头由部分双链和部分单链DNA结构组成，在适当的温度条件下形成稳定的双链结构，可以与目标DNA片段高效连接。

2）Illumina的接头设计为平末端连接，这意味着目标DNA片段需要通过末端修复步骤将所有DNA片段修整为平末端，以便与接头连接；而BGI的接头一端具有单链悬垂末端，使其能够与DNA片段的互补序列进行高效连接，减少非特异性连接的发生。

3）Illumina的接头设计主要用于Illumina的测序平台，与其他平台的兼容性较低；而BGI的接头则可以兼容Illumina和BGI。

（2）文库扩增

实际上，Illumina及BGI技术最大的不同在于文库扩增的原理，众所周知，Illumina平台采用的是桥式PCR扩增技术，而BGI则是滚环扩增技术，让我们来具体看看这两种技术的文库扩增流程~~

1）Illumina桥式PCR扩增步骤

A．FlowCell（流动池）：FlowCell是有着多个lane（泳道）的玻璃板，每个lane可以测一个样本或多样本的混合物，且随机布满了能够与文库两端接头分别互补配对或一致的寡核苷酸（oligos，P7和P5接头）。

B．第一链合成：将双链DNA文库变性解链成单链，当单链DNA模板流过每条泳道时，会被对应的接头捕获，被固定在芯片上，加入dNTP和聚合酶后，以原始模板链为模板，FlowCell上的接头为引物，合成第一链。

C．桥式PCR：加入碱性NaOH溶液，使DNA变性成单链，洗去原始模板链，新合成的链留在FlowCell上，加入中性液体中和，单链DNA弯曲，其顶部接头的序列与附近的oligos互补配对形成“单链桥”，加入DNA聚合酶、dNTP，合成互补链，形成“双链桥式结构”。变性双链的桥，得到与FlowCell相连的两条互补的单链DNA分子，单链DNA分子再一次弯曲，与附近的oligos互补配对形成桥式结构，以此不断重复便可完成DNA的扩增。这个过程称为“桥式PCR扩增”。桥式PCR扩增不断进行，直至形成足够的桥式DNA，形成Clusters。然后通过切断引物的特定基团，加入NaOH溶液解开双链桥式结构并选择性切除反向链，留下正向链，并封闭所有DNA分子的3'端，准备测序。

Illumina官网

2） BGI滚环扩增步骤

与Illumina不同，BGI的文库扩增步骤包括环化DNA片段，然后通过滚环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）生成大量的DNA纳米球（DNB）。这些DNB含有大量的DNA拷贝，便于在测序过程中进行高效的信号检测。

A．DNA单链环化：将带有接头序列的双链DNA(Double-stranded DNA，dsDNA)，通过高温变性形成单链DNA(Single-stranded DNA，ssDNA)，环化引物与ssDNA的两端互补配对，在连接酶的催化下，ssDNA的首尾相连接，形成单链环状DNA(Simgle-strand circular DNA，sscirDNA)。

华大智造官网

B．DNB制备：以单链环状DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行滚环扩增(RCA)，将单链环状DNA扩增到100-1000拷贝，扩增产物称为DNB。DNB通过简单的质量浓度质控后，就可以用于下一步的上机测序，操作简单，且不需要昂贵的定量设备和耗材。

基于RCA的线性扩增技术，每次扩增都是以原始的DNA单链环为模板，使用保真性极高的聚合酶，使得在DNB的所有拷贝的同一个位置上出同样的错的几率几乎是零。RCA扩增技术有效的避免了PCR扩增错误指数积累的问题，从而大大提高测序的准确性。

华大智造官网

在文库扩增阶段，Illumina和BGI平台的主要差别就在于Illumina使用传统的PCR扩增方法生成线性DNA拷贝，而BGI则采用滚环扩增（RCA）技术生成DNA纳米球（DNB）。这一扩增技术的差异不仅影响文库的扩增效率和误差率，也对后续的测序性能和数据质量产生重要影响。BGI的DNA纳米球技术通过生成高拷贝的DNA片段，提高了测序信号的强度和稳定性，成为了其在测序市场上的一大优势。

（3）上机测序

最后就是测序上机测序阶段啦~~这里Illumina平台采用的是边合成边测序技术（SBS）原理，华大则主要是联合探针锚定聚合技术（cPAS）。

1）Illumina上机测序步骤

A. 引物延伸：加入测序引物，使其结合至测序引物结合位点。

B. 荧光标记核苷酸的加入：加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，这些核苷酸是“可逆终止子”，其3’末端连接的是叠氮基团，使得每个循环只能延长单个碱基。

C. 信号检测：高分辨率相机检测每个克隆群发出的荧光信号，记录下每个碱基的位置。

D. 去除终止剂和荧光标记：去除核苷酸上的终止剂和荧光标记，使下一个核苷酸可以继续加入。

E. 循环重复：重复引物延伸、荧光标记核苷酸加入、信号检测和去除标记的过程，直至读取完所有的DNA序列。

F. 双端测序：在读取正向DNA链后，洗脱产物，继续读取反向DNA链的过程。

Illumina官网

2） BGI上机测序步骤

A. DNB加载：DNB在酸性条件下带负电，在表面活化剂的辅助下，通过正负电荷的相互作用，被加载到规则阵列载片中有正电荷修饰的活化位点，每个纳米孔中可以容纳一个或多个DNA纳米球。

B. cPAS技术：在DNA聚合酶的催化下，将测序引物锚定分子和荧光探针在DNB上进行聚合，洗脱掉未结合的探针后，在激光的作用下荧光信号被激发，随后利用高分辨率成像系统对光信号进行采集、读取和识别，从而获得当前待测碱基的序列信息，然后加入再生洗脱试剂，去除荧光基团，进入下一个循环的检测。

华大智造官网

C. 二链测序：在完成一链测序后，加入具有链置换功能的DNA聚合酶进行DNA二链合成反应，在持续的延伸过程中，当遇到双链结构的时候，在DNA聚合酶的解旋作用下，完成边解旋边复制的反应，形成大量的单链DNA作为二链测序的模板，然后杂交二链测序引物，开始二链的cPAS测序。利用DNA聚合酶的链置换特性，实现了DNB的双端测序，而且重新合成的二链拷贝数更多，能够获得更强的荧光信号，有效的提高了测序的准确性。

华大智造官网

主流产品型号及产出量ORIGINGENE

当前主流的二代平台包括Illmina的NovaSeq 6000、NextSeq 2000和NovaSeq X plus以及BGI的DNBSEQ-T7和DNBSEQ-G99，这些不同型号的测序平台在最小读长、最大读长、最大通量以及运行时间等方面有一些差异，但是测序数据质量及可用性相当。

注：资料来自于Illumina及BGI官网。

以上我们主要了解了Illumina和BGI平台在文库构建、扩增以及测序技术上的主要原理和主流产品产出量的差异，那么在实际应用中，这两种测序平台表现又是如何呢？且看下回分解~