高代谢率PBMC 复苏后需适应环境并恢复代谢。若复苏后细胞数量多或代谢活性高，会使二氧化碳产生量增加。二氧化碳与培养基中水反应生成碳酸，致培养基 pH 值下降。培养基含酸碱指示剂（如酚红），pH 值下降时从红色变黄色，使培养基发黄。例如，在细胞快速增殖时，对营养物质的需求大增，代谢加快，二氧化碳产生相应增多，导致培养基颜色变化更明显。

乳酸堆积细胞进行糖代谢时，除了有氧呼吸，在缺氧或代谢异常情况下会进行无氧呼吸产生乳酸。PBMC 复苏后可能存在局部缺氧或代谢调节不稳定的情况，使得乳酸生成增加。随着乳酸在培养基中积累，会导致培养基酸性增强，pH 值降低，进而引起培养基发黄。而且乳酸的积累还可能对细胞自身产生毒性作用，影响细胞的正常生长和功能。

细菌污染细菌是常见的污染源之一。如果在 PBMC 复苏过程中操作不当，如培养基或培养器具未彻底消毒、细胞在污染的环境中培养等，细菌就可能侵入培养基。细菌在培养基中会迅速繁殖，利用培养基中的营养物质生长代谢，产生多种代谢产物。一些细菌代谢产物会使培养基的颜色发生改变，通常会导致培养基发黄，同时可能伴有浑浊、异味等现象。例如，大肠杆菌污染后，会产生酸性代谢产物，使培养基 pH 值下降而发黄。

真菌污染真菌污染也不容忽视。真菌在适宜的条件下（如温暖、潮湿的环境）会在培养基中生长。与细菌污染类似，真菌生长过程中会消耗培养基中的营养成分并产生代谢产物。某些真菌的代谢产物可能导致培养基发黄，而且真菌菌丝体的生长可能会使培养基呈现出浑浊、丝状或絮状的外观。例如，念珠菌污染后，培养基可能会逐渐变黄，同时可见白色或浅黄色的菌丝体。

酚红氧化培养基中的酚红成分在一定条件下可能会发生氧化。酚红是一种酸碱指示剂，同时也具有一定的还原性。在接触空气、光照或某些化学物质时，酚红可能会被氧化，导致颜色改变。当酚红氧化后，其颜色会从红色逐渐向黄色转变，从而使培养基看起来发黄。这种氧化作用可能在 PBMC 复苏后的培养过程中逐渐发生，尤其是在培养基与空气接触较多的情况下。

营养物质消耗与代谢产物积累PBMC 在生长过程中会消耗培养基中的营养物质，如葡萄糖、氨基酸等。当营养物质被大量消耗后，培养基的成分比例发生变化，可能会影响其颜色。同时，细胞代谢产生的废物和其他代谢产物在培养基中积累，也可能与培养基中的成分发生反应，导致培养基颜色改变。例如，细胞代谢产生的氨等碱性物质与培养基中的酸性成分反应，可能会引起颜色变化，而发黄可能是其中一种表现。

培养环境因素温度和 pH 值的波动对 PBMC 的生长和培养基的稳定性有影响。如果培养箱的温度不稳定，过高或过低都可能影响细胞的代谢和培养基的性质。例如，温度过高可能加速细胞代谢和微生物的生长繁殖，导致培养基颜色变化加快。而 pH 值的异常波动，除了细胞代谢的影响外，还可能与培养箱中二氧化碳浓度调节不当等因素有关，进而影响培养基中酸碱指示剂的颜色变化。

细胞损伤与死亡PBMC 在复苏过程中可能受到损伤，如冷冻和解冻过程中的冰晶损伤、渗透压变化等。受损的细胞可能会释放出细胞内的物质，如酶、色素等，进入培养基中。当细胞死亡数量较多时，这些释放的物质会在培养基中积累，可能导致培养基颜色改变。例如，细胞内的一些含铁血黄素等物质释放后可能使培养基发黄。

优化细胞培养条件控制合适的细胞密度，避免细胞过度密集导致代谢产物堆积。在复苏 PBMC 后，根据细胞的生长特性和实验需求，合理调整接种密度。确保培养箱中气体环境稳定，提供适宜的氧气和二氧化碳浓度。例如，对于大多数细胞培养，二氧化碳浓度通常维持在 5% 左右，以维持培养基的 pH 值稳定。

定期更换培养基根据细胞的生长速度和代谢情况，适时更换培养基，以去除积累的乳酸和其他代谢产物。一般情况下，每隔 1 - 2 天可考虑更换部分或全部培养基，具体时间间隔可根据实际观察到的培养基颜色变化和细胞生长状态进行调整。

严格无菌操作在 PBMC 复苏及培养过程中，严格遵守无菌操作规范。对培养基、培养器具等进行彻底的消毒灭菌，可采用高压蒸汽灭菌、过滤除菌等方法。在细胞操作过程中，在无菌环境下进行，如在超净工作台中操作，操作人员应穿戴无菌工作服、手套和口罩等。

定期检测微生物污染定期对培养细胞和培养基进行微生物检测，可采用涂片染色、细菌培养等方法。如果发现有微生物污染的迹象，应及时采取措施，如丢弃污染的细胞培养物，对培养环境进行彻底消毒等。

正确保存和使用培养基培养基应按照说明书要求进行保存，一般需避光、冷藏保存，防止酚红氧化等成分变化。在使用前，应检查培养基是否有变质迹象，如颜色异常、浑浊等。尽量减少培养基与空气的接触时间，在打开培养基瓶后应尽快完成细胞接种和培养操作，避免长时间暴露在空气中。

监测培养基营养成分定期对培养基的营养成分进行检测，可采用生化分析等方法，了解营养物质的消耗情况。根据检测结果，及时补充或更换培养基，以保证细胞有充足的营养供应。

稳定培养环境定期校准培养箱的温度和二氧化碳浓度控制系统，确保培养箱内的环境稳定。每天检查培养箱的温度和二氧化碳浓度记录，及时发现异常情况并进行调整。同时，注意培养室的湿度控制，避免湿度过高或过低对细胞培养和培养基造成影响。

评估细胞质量和复苏过程在复苏 PBMC 前，对细胞的质量进行评估，确保细胞来源可靠、保存状态良好。优化冷冻和解冻过程，减少细胞损伤。例如，采用合适的冷冻速率和解冻方法，可使用程序降温仪进行冷冻，在解冻时采用快速升温的方式。对复苏后的细胞进行活力检测，如台盼蓝染色法等，及时了解细胞的存活情况。对于活力较低的细胞，应分析原因并采取相应的改进措施。

PBMC 复苏后培养基第二天发黄可能是由多种因素引起的。通过对这些原因的深入了解，并采取相应的解决措施和预防建议，可以有效地提高 PBMC 培养的质量和稳定性，为相关的科研和临床实验提供可靠的细胞模型和实验结果。在实际操作中，实验人员应密切观察细胞培养的各种现象，及时发现问题并进行处理，以确保实验的顺利进行。