引言

大脑是一台高速运转的生物计算机，其通过数百亿个神经元实时的将生命体对外部环境的感知转化为神经网络中的有序信号，处理并生成生命体对于这个世界的独特认知。在活体大脑中，实现对单个神经元大量突触及其神经递质信号动态的高通量、高时空分辨率记录，将有效推动我们对大脑智能的理解。双光子显微镜（Two-photon Microscopy, 2PM）结合先进的神经递质标记技术可在活体动物大脑中实现对神经元突触及神经递质信号的高分辨率成像。然而，常见的双光子显微镜存在时间分辨率低，三维成像通量不足，成像对比度、信噪比难以与高时空分辨率兼顾等短板，使其难以对三维脑空间内大量突触间快速的神经递质信号传递进行成像，阻碍了对突触功能空间拓扑结构的研究。

2024年6月19日，加州大学伯克利分校物理系Na Ji教授作为通讯作者，其团队的陈韡博士作为第一作者（现为华中科技大学机械科学与工程学院、高端生物医学成像重大科技基础设施双聘教授）在Nature Methods上发表研究长文“High-throughput volumetric mapping of synaptic transmission”【1】。他们提出并研发了贝塞尔液滴光双光子容积显微镜（Bessel-droplet 2PM），通过波前工程高效构建双环贝塞尔液滴光焦点，成功解决了三维大景深成像与高分辨率、高对比度成像之间的矛盾，有效抑制了高数值孔径贝塞尔光焦点的旁瓣伪影，在贝塞尔光双光子显微镜的基础上将分辨率（数值孔径）提升了约1倍，将成像对比度提升了近10倍。

同时利用该团队前期提出的计算光学焦面自适应光学技术（Wei Chen, et al, Nature Communications, 2021 【2】），证明了Bessel-droplet 2PM对复杂生物组织引入的波前畸变不敏感，是深部脑组织，细微结构（突触）、微弱信号（神经递质）高通量成像的优选方案。基于Bessel-droplet 2PM，他们成功实现了小鼠活体脑皮层中通量最高的突触神经递质成像：将通常需要多帧扫描才能实现的三维脑空间神经突触谷氨酸成像（<100个树突棘），提升到单帧就能实现对>1000个树突棘的元谷氨酸信号进行成像。进一步，利用这一高通量的活体神经递质成像技术，他们在小鼠视觉皮层三维脑空间中发现了从未被报道过的突触功能拓扑结构。

1.高分辨率、高对比度神经突触体成像

研究者采用自研的Bessel-droplet 2PM对转基因小鼠（Thy1-GFP小鼠）大脑皮层切片中的神经元树突及树突棘进行了成像。Bessel-droplet 2PM在低数值孔径下（NA=0.4）显著抑制了贝塞尔光焦点旁瓣所导致的成像伪影。提高数值孔径到NA=0.7, Bessel-droplet 2PM受益于较低的旁瓣伪影和像差不敏感性，仍然实现了对神经突触树突棘结构成像的衍射受限空间分辨率和较高的对比度。通过对比高斯光焦点（NA=1.05）,贝塞尔光焦点（NA=0.4，0.7）, 贝塞尔光焦点（NA=0.4，0.7）对紧邻的两个突触树突棘结构的成像，更进一步证明了Bessel-droplet 2PM可通过抑制旁边伪影显著提示突触成像的对比度，并实现与高数值孔径高斯光焦点相媲美的突触分辨率。

2.高通量树突棘谷氨酸信号成像

与常用的神经活动成像钙信号荧光探针不同，谷氨酸信号探针大量表达在神经突触的膜结构上，具有直接表征突触前神经递质输入信号而不受神经兴奋后向传导信号影响的优点【3】。但是谷氨酸信号探针动态过程短，荧光变化弱，对双光子焦点的激发效率，空间分辨率，成像帧率和对比度都提出了很高的要求。本文中研究者首先使用谷氨酸荧光探针对小鼠视觉皮层三维脑空间中的单个神经元进行了稀疏标记（图1a），然后利用Bessel-droplet 2PM对三维成像视场中>1000个突触树突棘的谷氨酸信号进行同步成像记录(图1b)，同时给予清醒小鼠移动光栅视觉刺激。实验证明，Bessel-droplet 2PM在活体小鼠大脑视觉皮层树突棘谷氨酸信号成像中可以显著提高对突触结构成像的分辨率和对比度（图1b,c），从而有效提升了突触树突棘成像的通量。

图1 |小鼠视觉皮层区(V1)谷氨酸兴奋性突触输入在体容积成像。(a) 小鼠视觉皮层（128 × 128 × 60 μm^3体积）内iGluSnFR-A184S标记的神经元及其三维树突结构。（b, c）分别用0.6 NA贝塞尔和贝塞尔液滴光焦点成像的相同体积。内嵌图显示图像的空间频域信息。下方显示为虚线橙色框的放大视图（贝塞尔图像具有7.1×的数字增益）。（Credit: Nature Methods）

更为重要的是受益于更高的数值孔径带来的荧光激发效率，在谷氨酸信号成像中实现了更高的信噪比。这些成像分辨率、对比度和信噪比的优势，促使研究者利用Bessel-droplet 2PM，发现了小鼠视觉皮层神经元突触在三维脑空间中新的功能拓扑结构：树突远端树突棘所接收到的谷氨酸信号更强(图2a)；树突棘上输入的方向选择性信号表现为微观簇状拓扑结构(图2b)。

图2 |小鼠视觉皮层区(V1) 谷氨酸信号突触前信号的在体容积成像。(a) 视觉刺激激发的神经元A和B树突棘上谷氨酸信号的峰值ΔF/F的空间分布。（b）视觉刺激激发的神经元A和B方向选择性的突触前信号输入的空间分布。（Credit: Nature Methods）

3.高通量视觉皮层突触与神经元视觉感受野成像

动物通过将感觉器官连接到大脑的途径来感知环境。在小鼠初级视觉皮层中，视觉刺激激发神经元的空间区域定义了神经元的经典视觉感受野。然而，视觉刺激激发突触的脑空间分布（突触的视觉感受野）的研究不够充分。究其原因，较低的突触信号成像通量是这一类研究的主要技术瓶颈。本研究中，研究者首先使用红色钙信号探针（jRGECO1a）和绿色谷氨酸荧光探针（iGluSnFR.A184S）对小鼠初级视觉皮层的单个神经元胞体钙信号和突触瓜氨酸信号分布进行了稀疏标记, 并通过钙信号成像确定了神经元视觉感受野的中心坐标。然后使用Bessel-droplet 2PM对这一神经元的神经元感受野和大量神经突触感受野进行了成像。通过高通量的突触视觉感受野成像，研究者仅使用1只小鼠便获取了与前期研究使用30只小鼠获取的等量的突触感受野成像信息。这一高通量的突触视觉感受野成像技术不仅验证了前期研究所报道的全局性的三维脑空间突触视觉感受野拓扑：较大的突触感受野倾向于分布在远端树突上【4】；也补足了前期研究所未能观察到的反向拓扑结构。

综上所述，贝塞尔液滴光双光子容积成像技术（Bessel-droplet 2PM）是一种高分辨，高对比度，高通量的在体生物组织成像技术，可与商业多光子系统实现便捷的集成。因此，研究者们期待Bessel-droplet 2PM可以被更多地运用到包括脑科学在内的更广泛的生物医学研究中。

参考文献

https://www.nature.com/articles/s41592-024-02309-3

责编|探索君

排版|探索君

文章来源|“BioArt”

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