细胞冻存是一种保存细胞的重要技术，以下是其详细步骤：

一、准备工作

细胞选择处于对数生长期的健康细胞进行冻存。因为这个时期的细胞活力高、状态好，在冻存后复苏时能有更好的存活率。例如，对于哺乳动物细胞系，如 HeLa 细胞，在培养至 70 - 80% 汇合度时比较适合冻存。

试剂和耗材冻存液：常用的冻存液配方是含有一定比例的血清、二甲基亚砜（DMSO）。一般是 90% 的胎牛血清（FBS）和 10% 的 DMSO。DMSO 是一种渗透性保护剂，可以降低细胞在冻存过程中的冰晶形成，减少对细胞的损伤。血清则提供细胞所需的营养物质和生长因子等。冻存管：选择合适大小和质量的冻存管，通常是 1 - 2ml 的无菌冻存管。要确保冻存管能够耐受低温并且密封良好，防止在冻存和储存过程中发生泄漏。标记工具：准备好标记笔或标签，用于标记冻存细胞的名称、日期、批次等信息。

二、细胞处理

胰蛋白酶消化（对于贴壁细胞）倒掉培养瓶中的旧培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗细胞 2 - 3 次，以去除残留的培养液和血清。血清会抑制胰蛋白酶的活性。加入适量的胰蛋白酶溶液，覆盖细胞表面，放入 37℃培养箱中消化 1 - 5 分钟，具体时间根据细胞类型而定。例如，成纤维细胞消化时间可能相对较短，大约 1 - 2 分钟，而一些上皮细胞可能需要 3 - 5 分钟。在显微镜下观察，当细胞变圆、开始脱落时，加入含有血清的培养液终止消化。血清中的蛋白质可以与胰蛋白酶结合，使其失去活性。用移液管轻轻吹打细胞，使细胞从培养瓶壁上完全脱落形成单细胞悬液。

收集细胞将细胞悬液转移到离心管中，1000 - 1500rpm 离心 5 - 10 分钟。离心速度和时间可以根据细胞大小和类型适当调整。例如，对于较小的淋巴细胞，离心速度可以稍低，如 1000rpm，时间 5 分钟左右；对于较大的细胞系，离心速度可以提高到 1500rpm，时间 8 - 10 分钟。离心结束后，小心地倒掉上清液，尽量不要扰动沉淀在管底的细胞。

重悬细胞加入适量的冻存液，用移液管轻轻吹打细胞，使细胞重新悬浮。细胞密度一般根据细胞类型和实验需求而定，通常冻存的细胞密度在 1×10⁶ - 1×10⁷个 /ml 左右。例如，对于一些较难复苏的细胞，如神经干细胞，可以适当提高冻存密度。

三、冻存过程

分装细胞将重悬好的细胞悬液分装到冻存管中，每管装 1 - 1.5ml 左右。在分装过程中要注意避免产生气泡，因为气泡可能在冻存过程中对细胞造成损伤。

梯度降温把装有细胞的冻存管放入程序降温盒中。程序降温盒内含有异丙醇等物质，其可以按照一定的速率缓慢降温。一般先将程序降温盒放置在 - 80℃冰箱中过夜，使细胞以大约 - 1℃/min 的速度缓慢降温。这种缓慢降温可以让细胞内的水分有足够的时间渗出细胞，减少冰晶在细胞内形成。

长期保存经过 - 80℃过夜后，将冻存管转移到液氮罐中进行长期保存。液氮的温度为 - 196℃，在这样的低温环境下，细胞的代谢活动几乎完全停止，能够长期保持细胞的活性。在转移过程中要注意防止冻存管暴露在常温环境时间过长，尽量减少温度变化对细胞的影响。

细胞冻存操作需要严格按照步骤进行，并且要注意无菌操作，以确保冻存细胞的质量和活性。