引言
RNA聚合酶II (RNA Pol II) 介导的转录是一个高度调控的多步骤过程，负责产生所有mRNA，在不同的步骤中由蛋白质复合物辅助。RNA Pol II在转录起始位点 (transcription start site，简称TSS) 的招募是通过染色质的打开以及通用转录因子和中介复合物的结合来协调的。在动物细胞中，RNA Pol II启动RNA合成，快速转录20至50个核苷酸，然后暂停【1-3】。RNA Pol II的暂停是由DRB敏感诱导因子 (DRB sensitivity-inducing factor，简称DSIF)、Spt4/spt5异源二聚体、负延伸因子 (negative elongation factor，简称NELF，是NELF- A, B, C/D和E的复合物) 这些因子结合而诱导的【3-7】。RNA Pol II从暂停中释放，则是由正转录延伸因子B (positive transcription elongation factor b，简称P-TEFb，是Cdk9和Cyclin-T的异源二聚体) 所诱导，PTEFb磷酸化RNA Pol II, DSIF和NELF，将DSIF转化为延伸因子并将NELF从RNA Pol II中解离。当RNA Pol II转变为有效延伸时，Spt6结合磷酸化的RNA Pol II, PAF1复合物结合到NELF解离暴露的表面。RNA Pol II通过基因转录，然后被终止，复合物从染色质上移除，用于后续的转录。
随着技术发展，学界对转录及其调控机制的理解也日益加深，但也存在很多不足，包括RNA Pol II的详细分子动力学及其在体内的关键调节因子。通过对RNA Pol II的结合、解离和重新结合，以及转录在特定位点的暂停和延伸的动力学测量可以用于构建转录机制模型。将这些测量与扰动相结合也可以阐明特定分子相互作用和酶活性的作用。然而，在单个基因转录过程中明确测量RNA Pol II和暂停/延伸因子动力学，在技术上仍然具有挑战性。
近日，美国康奈尔大学的John T. Lis研究组在Molecular Cell上发表题为Live-cell imaging of RNA Pol II and elongation factors distinguishes competing mechanisms of transcription regulation的文章，通过跟踪活细胞中的转录因子动力学影响，观察到RNA Pol II和DSIF在Hsp70转录时表现出相似的动力学，而P-TEFb和PAF1在邻近的Hsp70染色亲体之间迅速交换。延伸因子PAF1和Spt6表现出不同的结合动力学，但需要P-TEFb活性才能招募到Hsp70上。
为了研究RNA Pol II 和转录因子结合的解离动力学，作者使用新型基因工程方法、成像工具和更为特异的抑制剂对果蝇多染色体进行了活细胞成像。果蝇染色体尺度和结构较大，使得对编码特定蛋白质的基因位点进行实时成像成为可能。果蝇唾液腺的间期细胞核在经过十轮DNA复制而不分裂后，已经含有大量的染色体，每套染色单体大约有1000个拷贝并排排列，这样就可以很容易地观察到单个基因位点。尽管有高拷贝数，果蝇染色体转录的基本分子机制被认为与二倍体细胞相同。作者选取高度转录的、细胞学上可识别的Hsp70基因来测量RNA Pol II和多个关键调控转录因子的停留时间和动态，并通过CRISPRCas9生成了内源性光激活GFP(PA-GFP)和HaloTag敲入蛋白，在果蝇染色体中实现了跟踪的Hsp70位点的分子群。在热休克反应的早期，少量的RNA Pol II和DSIF被重复用于迭代的转录。令人惊讶的是，尽管通过染色质免疫沉淀 (ChIP) 检测发现PAF1q12和Spt6在整个基因体中都存在，但它们的结合行为却明显不同；PAF1复合体和Spt6仅在P-TEFB介导的暂停释放后才被招募到Hsp70上，并且PAF1与RNA Pol II的结合是短暂的，而与Spt6的结合时间更长，可能贯穿整个转录单元。作者测量了伸长因子Spt5、Spt6和PAF1的水平，发现它们彼此之间存在接近化学计量的水平，并且略低于RNA Pol II。最后，作者还观察到，当PAF1组分Cdc73缺失时，RNA Pol II仅在复合物需要通过核小体屏障时才存在延伸水平降低现象。综上所述，作者通过搭建的实时跟踪活细胞的转录因子动力学平台，发现了一套新的转录调控机制：在热休克早期，RNA Pol II和DSIF在转录过程中不再循环；P-TEFb和PAF1与RNA Pol II短暂结合，而可以与Spt6稳定地相互作用；PAF1有助于RNA Pol II的延伸，特别是当遇到核小体时。上述结果为转录调控的机制模型提供了新证据。
模式图（Credit: Molecular Cell）参考文献
1 Struhl, K. (1989). MOLECULAR MECHANISMS OF TRANSCRIPTIONAL REGULATION IN YEAST. Annu. Rev. Biochem. 58, 1051–1077. https:// doi.org/10.1146/annurev.bi.58.070189.005155.2 Klemm, S.L., Shipony, Z., and Greenleaf, W.J. (2019). Chromatin accessi- bility and the regulatory epigenome. Nat. Rev. Genet. 20, 207–220. https:// doi.org/10.1038/s41576-018-0089-8.3 Core, L., and Adelman, K. (2019). Promoter-proximal pause of RNA Polymerase II: a nexus of gene regulation. Genes Dev. 33, 1–24. https:// doi.org/10.1101/gad.325142.119.4 Adelman, K., and Lis, J.T. (2012). Promoter-proximal pausing of RNA po- lymerase II: emerging roles in metazoans. Nat. Rev. Genet. 13, 720–731. https://doi.org/10.1038/nrg3293.5 Chen, F.X., Smith, E.R., and Shilatifard, A. (2018). Born to run: Control of transcription elongation by RNA polymerase II. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 19, 464–478. https://doi.org/10.1038/s41580-018-0010-5.6 Qiu, Y., and Gilmour, D.S. (2017). Identification of regions in the Spt5 sub- unit of DRB sensitivity-inducing factor (DSIF) that are involved in promoter- proximal pausing. J. Biol. Chem. 292, 5555–5570. https://doi.org/10. 1074/jbc.M116.760751.7 Vos, S.M., Farnung, L., Urlaub, H., and Cramer, P. (2018). Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature 560, 601–606. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0442-2.https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.07.009责编|探索君
排版|探索君
文章来源|“BioArt”
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