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由创伤、退行性疾病、先天性畸形、骨肿瘤、感染、牙周病等原因引起的骨缺损在临床上普遍存在，且情况严重。尤其是当缺损的大小超过所谓的临界大小时，由于缺乏协调再生的模板，完全依靠自体骨修复机制通常无法愈合，需要手术干预。骨愈合是一个复杂的多阶段级联过程，主要包括三个阶段：炎症阶段、骨形成阶段和重塑阶段。骨自体移植或异体移植被认为是临床实践中的金标准治疗方法；然而，这些策略具有一定的局限性，包括自体骨供应受限、整合受损、免疫排斥、严重并发症和潜在的血液病传播。因此，为了寻求更可靠的治疗方法，人们开发了人工骨支架来修复骨缺损。此外，人们在大力开发人工骨支架的同时却忽视了骨膜的功能作用，导致骨愈合受到限制。一般来说，骨膜缺陷或功能障碍会影响血液供应和骨修复，导致愈合时间延长甚至不愈合。由于骨的自愈能力有限，有效修复大面积骨缺损仍是一项重大挑战。
受天然骨膜结构和功能的启发，来自福州大学的杨建民和石贤爱团队开发了一种电纺仿生骨膜，利用天然骨愈合机制促进骨再生。生物仿生骨膜由具有不对称结构的双层结构组成，其中排列整齐的电纺聚(ε-己内酯)/明胶/去铁胺（PCL/GEL/DFO）层模拟骨膜的外层纤维层，而随机同轴的电纺PCL/GEL/阿司匹林（ASP）外壳和PCL/硅纳米颗粒（SiNPs）核心层模拟骨膜的内层。双层结构可控制 ASP、DFO 和 SiNPs 的释放，从而精确调节骨修复的炎症、血管生成和成骨阶段。随机同轴的内层能有效抗氧化，促进细胞募集、增殖、分化和矿化，而排列整齐的外层则能促进血管生成，防止成纤维细胞浸润。特别是在大鼠颅骨缺损模型中，对骨修复的不同阶段进行调控，以实现更快更好的骨再生。所提出的生物仿生骨膜有望成为骨缺损愈合的理想候选材料。相关工作以题为“Electrospun Biomimetic Periosteum Capable of Controlled Release of Multiple Agents for Programmed Promoting Bone Regeneration”的文章发表在2024年02月13日的国际著名期刊《Advanced Healthcare Materials》。
1. 创新型研究内容
本研究受天然骨膜结构和功能的启发，开发了一种能够控制多种药物释放的仿生骨膜，以促进骨再生。这种具有不对称结构的仿生骨膜是通过电纺丝技术制备的。首先，通过对 PCL/GEL/DFO 进行对齐电纺丝制备外层。然后，在外层膜表面通过连续同轴电纺制备出由 PCL/GEL/ASP 外壳和 PCL/SiNPs 内核组成的内层。其中，排列整齐的 PCL/GEL/DFO 外层模拟了外纤维层。内层同轴纤维模拟了内层凸起层的结构。特别是，生物仿真骨膜促进了与骨愈合相适应的各个愈合阶段。此外，还在大鼠颅骨缺损模型中研究了生物仿生骨膜的成骨、破骨抑制、骨膜再生、血管生成和抗炎作用。
【仿生骨膜的形态和粗糙度表征】
本研究用扫描电镜观察了不同纤维膜的表面形态。R-PG、A-PG、R-PGD 和 A-PGD 纤维均匀、光滑，几乎没有珠状物（图 1A）。所有组别的纤维直径都在微米或亚微米级别。特别是，A-PG 和 A-PGD 纤维显示出排列整齐的结构，类似于天然骨膜的外层纤维。Coaxial-Si 和 Coaxial-B 纤维表现出多孔结构，由平滑和随机取向的纤维组成，模仿了骨膜内层的无序结构，而 Blend-Si 纤维则表现出更大的异质性（图 1B）。然而，由于电纺参数条件不同，Blend-Si 的纤维直径比 Coaxial-Si 和 Coaxial-B 更细。TEM 和荧光染色图像显示，Coaxial-Si 具有清晰的核壳结构（图 1C、D）。
图1 生物仿真骨膜的形态特征和粗糙度
【仿生骨膜的机械和物理特性表征】
经测量，生物仿生骨膜外层的抗拉强度为 5.6-10.5 MPa，明显高于内层（0.8-2.1 MPa）（图 2A）。此外，Bilayer-DFO/ASP/Si 和 Bilayer 都表现出了相当高的抗拉强度。值得注意的是，Bilayer-DFO/ASP/Si 的拉伸强度（7.7 ± 1.0 MPa）高于天然骨膜的拉伸强度（3.7-4.0 MPa）。生物仿生骨膜内层同轴纤维膜的断裂伸长率（164.7%-273.1%）明显高于外层纤维膜（10.1%-37.5%）（图 2B）。这一结果可归因于核壳结构能够均匀分布和释放应力，从而增强了同轴纤维的稳定性。经测量，双层-DFO/ASP/Si 的断裂伸长率为 171.3% ± 8.4%。总之，这些研究结果表明，仿生骨膜可为骨缺损提供良好的机械支持和保护。
仿生骨膜内外层的孔隙率均高于 75%，而两层的吸水率均高于 300%（图 2C、D）。高多孔结构和吸水性可促进细胞浸泡生长以及所需营养和活性物质的运输。对仿生骨膜两侧的表面润湿性进行了测量。A-PGD（60.9° ± 12.4°）明显高于 Coaxial-Si（31.1° ± 4.4°）（图 2E），这表明其具有非对称润湿性。内层亲水性的提高主要归因于粗糙度的增加。8 周后，A-PGD 和 Coaxial-Si 的降解率分别接近 20% 和 25%（图 2F、G）。应该注意的是，这种降解可能与骨再生相匹配，理想情况下，降解时间至少需要 2 个月。此外，扫描电子显微镜图像显示，生物仿生骨膜在降解 4 周后仍处于纤维状状态（图 2H）。
图2 仿生骨膜的机械和物理特性表征
【体外生物相容性、细胞粘附性和屏障功能测试】
本研究通过将 MC3T3-E1 和 HUVEC 细胞与仿生骨膜提取物一起培养，评估了仿生骨膜的生物相容性。活/死染色结果表明，各组细胞在培养过程中均正常生长，未观察到任何明显的细胞毒性效应（图 3A、B）。此外，CCK-8 检测证实所有组的仿生骨膜都具有良好的生物相容性（图 3C、D）。尤其是 Bilayer-DFO/ASP/Si 组在 HUVECs 和 MC3T3-E1 中的细胞增殖率最高，表明仿生骨膜能有效促进细胞增殖。细胞骨架/细胞核染色用于评估不同纤维方向细胞的粘附状态。A-PGD 和同轴硅表面有两种细胞粘附，分布相对均匀（图 3E）。图像中的肌动蛋白微丝清晰可见，表明仿生骨膜表面的细胞活性极佳。此外，A-PGD 表面的细胞是定向生长的，而 Coaxial-Si 则向各个方向延伸。
图3 仿生骨膜的生物相容性、细胞粘附性和屏障功能
【体外细胞迁移、巨噬细胞极化和血管生成试验】
伤口刮擦试验表明，A-PGD 和 Bilayer-DFO/ASP/Si 具有良好的伤口闭合能力，优于对照组、A-PG 组和 Bilayer 组（图 4A,B）。经孔试验表明，A-PGD 和 Bilayer-DFO/ASP/Si 促进细胞纵向迁移的能力更强（图 4C、D）。此外，与对照组相比，粘附在仿生骨膜上的 RAW264.7 能显著刺激细胞迁移，这表明它能通过诱导巨噬细胞极化来促进 HUVEC 迁移。特别是，双层-DFO/ASP/Si 表现出最佳的细胞迁移性，这可能是由于 ASP 和 DFO 的协同作用结合纤维结构的排列促进了巨噬细胞的极化，从而增强了细胞迁移性。
快速血管化是骨再生的必要阶段，尤其是在严重骨缺损的情况下。用仿生骨膜在 matrigel 上培养 HUVEC 6 h 后，小管形成后的代表性图像显示，与对照组、A-PGD 和 Bilayer 相比，Bilayer-DFO/ASP/Si 形成了更多的小管网络（图 4E）。根据网状结构和主节段数量的定量分析，A-PGD 和 Bilayer-DFO/ASP/Si 的网状结构和主节段数量较多（图 4F）。此外，VEGF 免疫荧光染色显示，Bilayer-DFO/ASP/Si 组的表达量显著增加（图 4G）。Bilayer-DFO/ASP/Si 组中 VEGF 的相对表达量达到 282.73% ± 7.58%（图 4H）。总之，这些结果表明，仿生骨膜除了能防止非致癌组织侵入损伤部位外，还能促进 HUVEC 的迁移、巨噬细胞极化和血管生成。
图4 仿生骨膜的体外细胞迁移、巨噬细胞极化和血管生成
【体外骨生成和 qRT-PCR 分析】
本研究通过ALP、ARS和qRT-PCR分析了仿生骨膜对体外成骨的影响。在膜上培养 7 天后，Coaxial-Si 和 Bilayer-DFO/ASP/Si 显示出更强烈的紫色，Bilayer-DFO/ASP/Si 在所有组中显示出最高水平（图 5A、B）。根据以往的报道，钙盐沉积和骨基质矿化是骨形成的重要阶段。同轴-Si 和双层-DFO/ASP/Si 在第 7 天和第 14 天产生了更多的钙结节，明显高于同轴-B（图 5C、D）。这是因为添加了 SiNPs，而 SiNPs 可促进矿化并加速钙结节的形成。通过 qRT-PCR 检测缺氧诱导因子（HIF-1α），以验证其促进血管基因表达的能力。结果显示，Bilayer-DFO/ASP/Si 对 HIF-1α 的上调有更强的刺激作用（图 5E）。这是因为 DFO 激活了 HIF-1α 信号通路并诱导血管生成活性。此外，本研究还检测了骨生成基因的表达，如胶原 I 型（Col I）、骨钙蛋白（OCN）、RUNT 相关转录因子 2（RUNX2）和骨桥蛋白（OPN）。与 Coaxial-B 相比，Bilayer-DFO/ASP/Si 能显著提高 Col I、OCN、RUNX2 和 OPN 基因的表达，这表明仿生骨膜具有增强成骨分化的能力（图 5F）。
图5 生物模拟骨膜的体外成骨试验
【大鼠皮下植入模型的生物相容性】
为评估生物仿生骨膜的生物相容性、抗炎、血管生成和成骨特性，本研究制作了大鼠皮下植入模型（图 6A）。H&E 和 Masson 染色显示，材料在组织界面处具有良好的生物相容性，没有明显的炎症反应（图 6B、C）。所有实验组都观察到了新生血管，与 Bilayer 组相比，Bilayer-DFO/ASP/Si 组的新生血管程度更高，血管内皮生长因子的产生量也显著增加（图 6D、F）。由于在早期释放了 ASP，Bilayer-DFO/ASP/Si 在 7 天时比 Bilayer 组释放了更多的抗炎因子 IL-10。双层-DFO/ASP/Si在14天时抗炎因子减少，炎症消退（图6G），这表明它在骨缺损的炎症阶段具有更好的抗炎特性。COL I 是细胞外基质（ECM）形成的早期成骨标志物。通过 COL I 免疫荧光染色，观察到 Bilayer-DFO/ASP/Si 的荧光强度明显高于 Bilayer，表明其具有早期成骨作用（图 6E，H）。这些结果表明，生物仿生骨膜能积极影响抗炎促进血管生成和异位成骨，这还需要在骨缺损模型中进一步验证。
图6 体内生物相容性评估
【体内编程促进骨-骨膜缺损的再生】
人工骨膜的构建对于其在骨移植、骨支架或直接替代天然骨膜方面的应用至关重要。通常采用大鼠颅骨缺损模型来验证人工骨膜的修复效果。需要强调的是，将填充物修复与人工骨膜相结合可显著提高其临床适用性；但本研究旨在研究生物仿生骨膜在大鼠颅骨缺损模型中修复骨缺损的有效性，而不加入填充物，从而确保对修复效果的明确评估。因此，为了进一步验证生物仿生骨膜的体内成骨效果，本研究建立了大鼠颅骨缺损模型，并用生物仿生骨膜替代了原生骨膜（图 7A）。术后 4 周和 8 周，通过显微 CT 和组织学分析评估新骨组织的再生情况。Bilayer 和 Bilayer-DFO/ASP/Si 的修复效果优于对照组和商用 Heal-all 胶原膜（图 7B）。其中，Bilayer-DFO/ASP/Si的修复效果最好，这是由于生物仿生结构和程序修复机制对骨生成的协同作用。其中，商业组在植入 4 周后完全降解，无法实现骨缺损的长期修复，而 Bilayer-DFO/ASP/Si 仍能保持完整的膜结构。Bilayer-DFO/ASP/Si 的骨体积分数（BV/TV）（图 7C）、骨矿物质密度（BMD）（图 7D）和骨小梁数（Tb.N）（图 7E）均显著高于其他组。BMD 的升高是由于添加了 SiNPs，而 SiNPs 可以增加体内的骨矿物质密度。
图7 体内骨修复评估
对代表性炎症、血管生成、成骨细胞生成、破骨细胞生成和骨膜进行了组织学分析。在 4 周和 8 周时，Bilayer-DFO/ASP/Si 中的 OCN 和 OPN 与其他组相比明显升高，表明生物仿生骨膜具有良好的骨修复能力（图 8A,B）。Bilayer-DFO/ASP/Si 中 VEGF 和 CD31 的表达水平明显高于其他组（图 8C,D）。此外，Si 离子的释放对骨生成和血管生成有刺激作用。骨缺损后，炎症反应增加，巨噬细胞 M1 和 M2 表型之间的平衡被打破。因此，需要改善炎症和促进巨噬细胞极化。术后 4 周和 8 周，Bilayer-DFO/ASP/Si 中 TNF-α 的表达明显减少，这可能是由于 ASP 的释放所致（图 8E,F）。CD206 表达的增加和 iNOS 表达的减少表明巨噬细胞成功地从 M1 极化为 M2，从而改善了骨缺损部位的免疫调节（图 8G,J）。
图8 骨愈合效率评估
2. 总结与展望
通过模拟天然骨膜的结构和功能，本研究成功开发了具有非对称结构的电纺仿生骨膜，用于骨缺损的程序修复。制备出的仿生骨膜具有优异的机械性能、高生物相容性以及 ASP、DF 和 SiNPs 的可控释放能力。值得注意的是，排列整齐的纤维外层能有效防止软组织入侵并促进血管生成，而同轴内层则具有抗炎、抗氧化和成骨细胞增殖与分化活性。体内研究结果表明，多种药剂释放的仿生骨膜具有增强骨修复的特性，有利于大鼠颅骨缺损的骨再生。总之，将多种制剂整合到电纺不对称双层膜中，用于骨愈合的各个阶段，开发出了结构和功能仿生骨膜，为骨再生提供了一种新方法。
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