上一篇文章介绍了关于MRD的基本概念、分析策略和检测时间点，详情见（MRD（分子残留病灶）知多少？我们为什么需要关注它（上））。
本文将继续对MRD的临床意义、检测难点进行阐述。
一、临床意义
目前，MRD在实体瘤当中应用的临床意义主要集中在：预后分层、复发监测、疗效评估、药物假期等，其他应用场景还包括临床试验替代终点、基于新辅助治疗反应的手术决策以及临床试验受试者入组筛选。
01.预后分层
MRD在实体瘤当中预后价值研究的较为充分的包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌等。吴一龙教授“肺癌三部曲”中第一部的研究入组261名患者，中位随访时间19.7个月。当整合纵向时间点时NPV和PPV分别增加到96.8%和89.1%。换句话说，在纵向检测不到MRD的患者中，有96.8%的患者在最后一次随访时仍然处于无病状态(其中70.1%处于I期，17.4%处于Ⅱ期，12.5%处于III期)。纵向时间点检测不到MRD患者与治愈人群相对应，并且不受临床分期的影响[1]。提示在18个月内纵向检测不到MRD的患者可能是治愈人群。
在今年刚发布的一项针对156名原发性乳腺癌患者在手术和辅助化疗后接受长达12年的临床监测。半年收集一次的血液样本，在34名复发的患者中，有30人的ctDNA在临床或放射学复发之前被检测到。复发预测的时间间隔最长可达38个月(中位数为10.5个月)，ctDNA阳性与无复发生存期和总生存期较短有关。结果同样提示术后连续ctDNA评估具有强大的预后价值，为早期治疗干预提供了一个潜在的窗口，并且可能比目前的临床常用方法(如癌抗原)更有效[2]。
个性化ctDNA检测在连续血浆样本中预测无复发生存率和总生存率[2]
02.复发监测
LUNGCA-1研究纳入了330名I-III期NSCLC患者，分别于三个围手术期时间点(术前、术后3天和1个月)检测。结果证实，MRD阳性(术后3天和/或1个月的ctDNA阳性)是疾病复发的强预测因子。基于ctDNA的MRD对RFS预测的相对贡献高于所有临床病理变量，例如TNM分期。此外，接受辅助治疗的MRD阳性患者比未接受辅助治疗的MRD阳性患者RFS有所改善，而接受辅助治疗的MRD阴性患者的RFS反而低于未接受辅助治疗的MRD阴性患者。研究提示围手术期ctDNA分析可有效早期发现MRD和非小细胞肺癌复发风险分层，有利于非小细胞癌患者的管理[3]。
围手术期ctDNA对非小细胞肺癌患者预后的影响[3]
在临床决策中使用ctDNA的实用性建议指出，术后ctDNA-MRD检测阳性的患者，复发风险近乎100%[4]。
预后好的患者往往复发风险低，预后不好的患者往往复发风险高，这两方面都是高度统一的。对于预后和复发的监测单个时间点的MRD状态预测价值有限，应观察长期结果。
03.疗效监测
MRD对治疗效果的预测评估引出了另一个概念：适应性治疗。其定义为“利用生物标志物精准选择患者，在标准治疗的基础上实施降阶或者升阶治疗，以期获得更佳的疗效、更高的生活质量和/或更好的成本效益”。ctDNA-MRD作为适应性治疗的标志物，目前证据支持阳性用于指导升阶治疗，阴性用于降阶治疗，但需要更多的临床试验确认[1]。一项研究显示III期不可切除NSCLC患者接受放化疗后，MRD持续阴性者2年DFS可达88.4%，达到了潜在治愈。同时，CRT早期达到MRD阴性患者预后较好，接受/不接受免疫巩固治疗预后相当，提示了MRD在局部晚期NSCLC治疗中潜在减治疗指导价值[5]。
目前研究显示，在ctDNA-MRD足够准确，阴性预测值超过90%的前提下，临床和科研工作者可以依据ctDNA-MRD检测结果将患者分为治愈人群（ctDNA-MRD阴性）和高危人群（ctDNA-MRD阳性）。对于治愈人群，可以考虑停止治疗，仅进行密切监测；对于高危人群，则需要在标准治疗的基础上，进行联合治疗或者强化治疗。这一结论已在多个研究中被反复证实[6]。
04.药物假期
上文提到的适应性治疗目前临床可能更关注的是降阶治疗。在今年发布的“肺癌三部曲”的第三部研究证明了药物假期在肺癌领域应用的可行性。研究入组60名经TKI和LCT治疗后未复发的晚期NSCLC患者，经过前期治疗（手术/放疗）后，经PET确认达到影像学CR状态，同时CEA（癌胚抗原）/血液ctDNA-MRD达到阴性并停止靶向药物，进入“药物假期”，此阶段开始需定期复查（影像学+CEA+ctDNA），出现任一检查的阳性结果，则重新用药。结果显示，A组（持续监测无异常，仍在停药状态）患者的PFS率高达100%，这类患者约占13%；B组（严密监测下出现血液标志物CEA/ctDNA阳性而重新用药）患者的中位PFS达到20.2个月，超越了第三代EGFR-TKI在一线治疗时的中位PFS，这类患者约占50%多；C组（患者停药阶段出现影像学的疾病进展，重新用药）患者的中位PFS为5.5个月。结果表明，采用适应性降阶治疗策略可以让70%以上的患者获益，且推迟耐药时间，延长靶向用药的有效区间，中位“药物假期”的时长可达9.1个月，并且患者再次出现MRD阳性后，对于靶向药物仍然敏感，总体患者的中位PFS为18.4个月[7]。
《非小细胞肺癌适应性治疗中国专家共识》提到：EGFR突变IV期非小细胞肺癌经过系统和局部治疗后，影像学无可见或无代谢肿瘤病灶时，可考虑药物假期，需在生物标志物指导下实行适应性治疗[8]。
随着诊疗手段的发展，很多癌症已成为慢性病，越来越多的患者处于“带瘤生存”的状态，在治病的同时也要保证生活质量。这就对患者的定时监测、药物使用和治疗决策提出了更高的要求，正确理解和使用MRD可以为肿瘤患者带来巨大收益。
除上述意义外，MRD动态监测还有望将临床试验终点提前，缩短临床试验时间，降低药物研发的成本，同时有助于肿瘤药物快速上市或加速已上市药物的适应症拓展。检测血液ctDNA水平是一种在抗癌治疗期间监测肿瘤反应和基因变异变化的无创性方法，并且可以作为生物标志物来辅助实体瘤药物开发。近年来，FDA已经批准了几项基于ctDNA的辅助诊断试验，使安全有效的靶向治疗成为可能[9]。制药企业可利用所试药物治疗后MRD的转阴作为依据为患者分层，从而有助于制药企业更好地证明药物疗效，提高药物上市成功率[10]。
二、检测难点
正如上文所说，目前MRD检测中最受关注的是其检测敏感性问题，其阴性预测值能否达到90%以上，此问题又可拆分为突变个性化保证、测序深度高和有效深度的平衡及降噪算法。
01.突变个性化保证
肿瘤患者突变具有个性化特点，每个肿瘤患者的突变谱具有较高的分子异质性，同时患者个体中仅携带非常少量相同的基因突变。
02.测序深度高和有效深度的平衡
早中期实体瘤患者释放到外周血中的ctDNA含量一般较少，ctDNA含量一般低于1%，需要较高的测序深度，但也存在有效深度饱和的瓶颈。采用NGS检测方法的基本技术标准是可稳定检出丰度≥0.02％的ctDNA。
03.降噪算法
降噪要求高，单纯地增加测序数据量和深度会带来严重的背景噪音和克隆性造血突变检出等问题，可能导致MRD结果的假阴性或假阳性，降噪算法是MRD检测的关键技术。
从硬件设备方面，对测序仪通量要求高，需要匹配中高通量的测序仪来进行测序；
从软件生信方面，如何排除测序错误及背景信号的干扰，从“超高深度”的reads中识别出“个位数”的真实变异reads，这需要UMI分子标签、高性能的生信算法流程等技术加持，更需要生信专业人士对数据分析、报告结果进行严格的审核，才能真正地将技术转化为检测中的优势。
克隆造血(CHIP)或非肿瘤性造血干细胞的DNA片段可导致假阳性ctDNA结果。可以通过先进的生物信息学分析或ctDNA测序与白细胞和/或匹配肿瘤组织的比较来减少这些假阳性结果[11]。因此，建议对白细胞进行额外的NGS分析，以排除芯片相关的变异，尤其是在MRD或早期癌症检测的情况下。落地MRD检测后，个体化定制panel在生产和使用环节都应有严格的质量管理措施，例如每条探针的质控信息，每个位点的覆盖水平等等，严格的质控也是为了得到更精准的检测结果。Tumor-informed路线是基于原发肿瘤组织的变异信息，形成每个患者个性化的变异图谱并利用其进行MRD监控。个性化panel策略选取每位患者肿瘤特异性的主克隆位点形成个性化基因变异图谱，更加符合肿瘤异质性特征，提高MRD动态监测的精确性，能最大化地体现MRD动态监测能力。ctDNA检测时通过配对的白细胞样本，或者汇集整合检测到的克隆性造血突变，构建克隆性造血突变背景库，可有效帮助去除克隆性造血造成的假阳性[12]。
灵敏度、特异性、克隆异质性、生信分析、阳性判读与报告解读同样是MRD的难点，均尚未有统一标准亦未达成共识，仍处在探索阶段。当前之需是尽快建立对MRD检测产品性能的评价标准;开展前瞻性临床研究以帮助MRD检测过渡到标准临床实践;继续积累临床试验以及真实世界研究数据来优化、完善MRD检测技术/产品。
三、飞朔生物检测策略
飞朔生物自主研发的实体瘤分子残留病灶(MRD)检测产品分为定制化Panel检测策略和固定化Panel检测策略。定制化Panel先对原发肿瘤组织进行全面的全外显子测序，确定患者特异的基因突变结果，然后定制个性化Panel对组织中的一定数量的突变位点进行后续的ctDNA检测。
固定化Panel是基于血浆ctDNA的固定panel检测。Panel更大，覆盖位点多，中高深度测序(5万X)，可对耐药/获得性耐药监测及疗效评估，纳入肺癌、结直肠癌、胃癌和肝癌4个癌种194个基因CDS或者热点区域，驱动基因、靶向用药、免疫相关基因，补充高频突变的非驱动基因。检测范围更广，检测更加灵敏。
参考文献
[1] Cancer Discov 2022 Jul 6;12(7):1690-1701.
[2] JCO Precis Oncol 2024 Apr:8:e2300456.
[3] Clin Cancer Res 2022 Aug 2;28(15):3308-3317.
[4] Nature 2023 Jul;619(7969):259-268..
[5] Cell. 2023 Oct 9;41(10):1763-1773.e4.
[6] ctDNA-MRD指导下的肺癌适应性治疗未来肺癌精准治疗方向
[7] JAMA Oncol 2024 Jul 1;10(7):932-940.
[8] 非小细胞肺癌适应性治疗中国专家共识
[9] CPT Pharmacometrics Syst Pharmacol . 2024 May;13(5):691-709.
[10] MRD动态监测与癌症术后治疗策略革新
[11] Front Genet. 2023 Aug 10:14:1172108.
[12] ctDNA高通量测序临床实践专家共识（2022年版）
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