编者按
GIP和GLP-1是在营养物质摄入后的几分钟内由胃肠道分泌，可增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌的肠促胰素。然而，控制肠促胰素内源性分泌的细胞机制仍然知之甚少。上篇文章中（Nature子刊重磅（上篇）：揭秘肠促胰素GLP-1/GIP促分泌全新机制，或将推进降糖减肥新药研发！），我们介绍了电压门控钾通道家族H成员2（KCNH2）钾通道在调节肠内分泌细胞（EECs）分泌肠促胰素中的作用及其机制，为开发出一类全新的药物——GLP-1/GIP促泌剂成为新的可能！本文将围绕该项研究的探索过程及结果进行详述。
KCNH2增强肠促胰素分泌水平的机制揭秘
01
KCNH2在肠促胰素分泌的EECs中表达
研究显示，KCNH2在所有五类肠道细胞（EECs、肠上皮细胞、潘氏细胞、簇细胞和杯状细胞）中都有表达，其中在EECs中的表达最高，在十二指肠中的表达高于回肠（图1a-c）。
图1. KCNH2在肠促胰素分泌的EECs中表达
此外，免疫荧光结果表明，KCNH2在十二指肠中与GIP共定位，在回肠中与GLP-1共定位，提示KCNH2存在于产生GIP的K细胞和产生GLP-1的L细胞（图1c，d）。需要注意的是，KCNH2的表达不仅限于这两种肠内分泌细胞，还在其他肠内分泌细胞中也有表达，正如scRNAseq数据所示。这些发现表明，KCNH2在K细胞和L细胞中均有表达，并且K细胞中的KCNH2表达高于L细胞。
02
KCNH2肠道条件性敲除小鼠的构建
作者构建了KCNH2肠上皮细胞条件性敲除小鼠（KCNH2fl/fl；Vil1-iCre，以下简称CKO）和对照小鼠（KCNH2fl/fl），发现CKO小鼠的十二指肠和回肠中KCNH2的表达显著减少，而KCNH2的敲除并未影响GIP/GLP-1的基础水平/分布（图1c，d）。
在正常饲料饮食条件下，KCNH2 CKO小鼠的体重与对照小鼠相比没有变化。然而，在高脂饮食（HFD）的情况下，KCNH2 CKO小鼠的体重增加缓慢，并且显著低于对照小鼠。除体重外，还监测了食物摄入量和饮水量，结果发现CKO小鼠的食物摄入量低于对照组，而两组之间的饮水量没有变化。
作者还评估了成年小鼠（12周龄）的各种参数，观察到CKO小鼠的体长和小肠长度（归一化为体长）与对照组相当。成年CKO小鼠的肠道整体形态、肠绒毛高度和隐窝深度与对照组一致。CKO小鼠的胰岛形态、大小和数量与对照小鼠相比没有变化。
这些结果表明，在HFD条件下，肠道KCNH2敲除导致小鼠的食物摄入量减少和体重增加减少，但对小肠和胰岛的生长没有影响。
03
KCNH2缺失通过促进肠促胰素分泌而降低血糖水平
CKO小鼠和对照小鼠之间的基础血糖水平没有差异。然而，口服葡萄糖耐量试验（OGTT）显示，CKO小鼠的葡萄糖代谢能力改善（图2a）。有趣的是，在腹腔注射葡萄糖耐量试验（IPGTT）中，CKO小鼠与对照小鼠之间的血糖水平没有差异（图2b），这表明肠道KCNH2敲除对胰岛功能没有影响。KCNH2敲除通过增加肠促胰素水平调节葡萄糖稳态，而与胰岛素敏感性无关。
图2. KCNH2缺失在体内增强了葡萄糖诱导的胰岛素和肠促胰素分泌
作者检测了高脂饮食诱导的KCNH2 CKO和对照小鼠在葡萄糖负荷后其他血清肠道激素的浓度。结果显示，KCNH2 CKO小鼠在葡萄糖耐量实验后表现出较高的肽YY（PYY）和生长抑素水平，但血清中的胆囊收缩素（CCK）浓度正常。
此外，研究显示，CKO和对照小鼠之间的肠道微生物群组成、多样性或丰度没有显著差异。这表明肠道KCNH2敲除对肠道微生物群的多样性、丰度或组成没有影响。
04
肠道KCNH2缺失不影响肠促胰素的合成和降解
作者进一步探讨KCNH2在肠道细胞中的作用。分别从KCNH2 CKO和对照小鼠的十二指肠或回肠中分离出原代肠上皮细胞（PIEC），qRT-PCR和Western blotting验证了CKO小鼠的十二指肠和回肠PIEC中KCNH2的mRNA和蛋白水平显著降低（图3a–c），而GIP和GCG的mRNA水平与对照组没有差异（图3c）。
图3. KCNH2缺失的PIEC显示出增强的肠促胰素分泌
作者分析了对照组和KCNH2 CKO小鼠十二指肠和回肠PIEC在基础和葡萄糖刺激条件下PCSK1和PCSK2的表达。结果显示，两组肠上皮细胞中PCSK1和PCSK2的mRNA水平在基础和葡萄糖刺激条件下均无变化。这些结果表明，肠道KCNH2缺失不会改变肠上皮细胞中PCSK1和PCSK2的表达。
05
KCNH2缺失的肠道细胞表现出增加的肠促胰素分泌
作者推测KCNH2缺失可能参与了肠促胰素的分泌。为验证这一假设，作者首先在基础条件下，观察到KCNH2敲除对GLP-1和GIP的分泌没有影响（图3g,l）。然而，在葡萄糖刺激下，来自KCNH2 CKO小鼠的PIEC显示出增加的GIP和GLP-1分泌，且对GIP的影响更为显著（图3d,i）。但CKO组和对照组小鼠在总GLP-1和GIP水平上没有差异，表明KCNH2敲除不影响肠道细胞中GIP和GLP-1的表达（图3h,m）。
在额外刺激的影响评估中，cAMP激动剂（forskolin+IBMX）显著增强了KCNH2 CKO PIEC中GIP分泌，并导致GLP-1水平的轻微增加（图3e，j）。相反，α-LA刺激（模拟脂肪酸刺激）仅导致GIP和GLP-1分泌的轻微增加（图3f，k）。
这些发现表明，在营养物质刺激后，KCNH2的缺失增强了肠促胰素的分泌，特别是GIP的分泌，而不影响肠促胰素的含量。
06
KCNH2敲低增加了肠促胰素的分泌
为了探讨KCNH2调节肠促胰素的具体分子机制，作者使用了体外培养的STC-1细胞，这是一种成熟的小鼠肠内分泌细胞系，能够分泌包括GIP和GLP-1在内的多种激素。免疫荧光染色结果显示，KCNH2存在于STC-1细胞中，并与GIP和GLP-1共定位（图4a）。为了评估KCNH2通道的敲低是否影响STC-1细胞的肠促胰素，作者采用siRNA敲低STC-1细胞中KCNH2的表达。qRT-PCR验证了KCNH2表达相对于对照组（siRNA-NC）显著减少（图4b）。
图4. 刺激后KCNH2敲低的肠内分泌细胞中肠促胰素分泌增加
KCNH2表达的减少并未影响总的GIP和GLP-1含量（图4g，l）。随后，作者刺激STC-1细胞以观察KCNH2敲低对肠促胰素分泌的影响。在基础条件下，两组间的肠促胰素分泌没有变化（图4f，k）。然而，在葡萄糖或forskolin+IBMX刺激后，KCNH2敲低显著增加了GIP和GLP-1的分泌，而α-LA刺激则仅使肠促胰素分泌略微增加（图4c–e，h–j）。
07
KCNH2敲低抑制Kv钾电流，延长APD并增加了钙离子浓度
作者使用小鼠肠内分泌细胞系STC-1细胞来研究电生理机制。采用siRNA抑制STC-1细胞中的KCNH2表达。由于KCNH2是电压门控钾通道家族的成员，作者记录了全细胞总钾电流（图5a）。分析显示，与对照细胞相比，KCNH2 siRNA处理的STC-1细胞中钾电流显著降低，且电压越高，电流下降更为明显（图5b–d）。
图5. KCNH2敲低抑制了肠内分泌细胞中的钾电流，延长APD，并增加了钙离子浓度
为确定KCNH2敲低对STC-1细胞中APD的影响，作者在电流钳模式下诱导动作电位。结果显示，与对照细胞相比，KCNH2 siRNA处理的细胞动作电位的复极化时间延长（图5e，f）。然而，两组的动作电位幅度和静息膜电位没有显著差异（图5g，h）。
为了进一步研究KCNH2通道在钙稳态中的作用，作者使用siRNA抑制STC-1细胞中的KCNH2表达，并测量了高葡萄糖及forskolin+IBMX刺激后的胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）反应。与对照组（siRNA-NC）相比，作者观察到KCNH2 siRNA处理的STC-1细胞在刺激后细胞内钙离子浓度增加（图5i）。
作者使用钙螯合剂EGTA检测STC-1细胞在葡萄糖刺激下的肠促胰素分泌。结果显示，在葡萄糖刺激后，KCNH2下调的STC-1细胞中GIP和GLP-1分泌显著增加。然而，在KCNH2下调组和对照组的STC-1细胞中加入EGTA后，GIP和GLP-1的分泌都减少（图5j，k）。这些结果表明，KCNH2下调或对照组STC-1细胞的葡萄糖刺激肠促胰素分泌是钙依赖的。
综上所述，KCNH2通道调节复极化钾电流，其减少会导致APD延长，并在葡萄糖刺激的STC-1细胞中增强[Ca2+]i。
08
多非利特促进小鼠体内和体外EECs的肠促胰素分泌
作者使用KCNH2特异性抑制剂多非利特来探讨其对肠促胰素分泌的影响。发现：
多非利特显著增加了对照组STC-1细胞中葡萄糖诱导的GLP-1和GIP分泌，然而对KCNH2敲低的STC-1细胞没有显著促进作用（图6b,c）。
多非利特可增强葡萄糖刺激后STC-1细胞的细胞内钙水平，表明KCNH2的阻断提高了细胞内钙浓度，从而进一步促进了STC-1细胞的肠促胰素分泌。
多非利特使十二指肠原代上皮细胞GIP分泌增加30%，使回肠上皮细胞GLP-1分泌增加20%。多非利特对KCNH2 CKO小鼠肠上皮细胞无显著影响，既不促进GIP分泌，也不促进GLP-1分泌（图6d-e）。
图6. 多非利特促进小鼠体内和体外肠内分泌细胞的肠促胰素分泌
作者用多非利特或对照溶剂给HFD诱导高血糖的C57BL/6 J小鼠灌胃。口服葡萄糖负荷后，多非利特显著降低了HFD喂养的小鼠的血糖水平，并增加了GLP-1、GIP和胰岛素水平（图6f–i）。这些结果表明，多非利特通过阻断KCNH2增加细胞内钙浓度，从而增加肠促胰素的分泌并改善葡萄糖稳态。
致谢：本项目获得国家自然科学基金重点项目资助（81930019）。
