患者和样本

该研究包括三名受HS影响的患者，这些患者在接受阿达木单抗治疗后出现牛皮癣样皮肤损害（40 mg，每周），三名受经典斑块型牛皮癣影响的患者（PASI 8、11.5和10）。在IDI-IRCCS地方道德委员会（Prot。CE 475/2016）的许可下，从患者收集了临床数据以及皮肤活检和血液。

8毫米皮肤活检取自HS患者中出现的牛皮癣样病灶或1.5个月大的银屑病斑块。活检分为免疫组织化学和皮肤浸润T淋巴细胞分离两部分。使用2 ml的外周血样品提取DNA，而使用20 ml的样品分离外周血单核细胞（PBMC）。

免疫组织化学

用H＆E对5μm石蜡包埋的皮肤切片进行染色或进行免疫组织化学处理。使用的主要抗体如下：抗BDCA2（DDX0043-TDS，Dendritics，里昂，法国），抗CD15（＃347420，BD Biosciences，米兰，意大利），抗IL-17A（＃AF-317-NA） ，R＆D Systems（英国阿宾登），抗淋巴毒素（LT）-α（＃SC8302，美国德克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯生物技术公司），抗IL-22（＃NB100-733，Novus Biologicals，百年纪念， CO，美国），抗IFN-（＃H00056832-M01，台湾亚诺瓦），抗CD117和抗CD11C（＃MONX10234和＃MON3371，荷兰乌登莫诺桑），抗CD68和抗CD3（＃P02246IT和＃A0452，达科，格洛斯特鲁克，丹麦）。

以下抗体来自Abcam（英国Cambridge）：抗IFN-γ（＃AB218426），抗IL-36γ（＃AB156783），抗IFN-β1（＃AB180616）和抗LT-β（猫＃AB64835）。使用二氨基联苯胺HRP底物开发了免疫反应性。用Mayer苏木精对切片染色。

从皮肤活检和FACS分析中分离T细胞，如先前所述，从皮肤活检样本中分离出T淋巴细胞。4-7天后，从活检中移出的动物被收集并进行表型鉴定。淋巴细胞用以下单克隆抗体（mAb）染色：抗IFN-γ-FITC（＃B27），-CD4-PE（＃RPA-T4），-CD8-PeRcP（＃SK1），-CD3-FITC（＃ HIT3a）（BD Biosciences）；抗TNF-α-FITC（＃6n1E7，Miltenyi Biotec，贝尔吉施，德国），-IL-17-PE（＃eBio64DEC17，EBiosciences，法兰克福，德国）; 抗IL-22-PeRcP（＃142928，R＆D系统）。使用Attune Nxt（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司）进行采集。使用Flow逻辑软件（Miltenyi Biotec）进行分析。

统计数据

Wilcoxon的符号秩检验（SigmaStat；美国加利福尼亚州圣拉斐尔）用于比较HS和银屑病患者皮肤活检中mRNA含量的差异。使用未配对的Student's t检验计算皮肤活检中免疫反应细胞数量差异的显着性。使用Prism v.5.0（Graphpad，La Jolla，CA，USA）进行统计分析，其值表示为平均值+ SD。p <0.05的值被认为是显着的。

实时PCR分析

使用RecoverAll总核酸分离技术（Life Technologies）从皮肤活检中提取总RNA，并通过实时PCR分析[27]。引物组如下：

IFN-α2A，5 [0] TCTGCTATGACCATGACACGAT3 [0]/5 [0] CAGCATGGTCCTCTGTAAGGG3 [0]；IFN-β，5 [0] CAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGC3 [0] / 5 [0] TCATCCTGTCCTTGAGGCAGT3 [0]；

IFN-λ1，5 [0] AGGCTTCTCCAGGTGAGGGA3 [0]/5[0] TCC AGGACCTTCAGCGTCAG3 [0]；

IFN-λ2，5 [0] GGGCCTGTATCCAGCCTCAG3 [0]/5[0] GAG CCGGTACAGCCAATGGT3 [0]；

IFN-λ3，5 [0] GGGCCTGTATCCAGCCTCAG3 [0]/5[0] GGT GCAGCCAATGGTGGAG3 [0] /；

LL-37，5 [0] TTTTGCGGAATCTTGTACCCA3 [0]/5[0] TCT CAGAGCCCAGAAGCCTG3 [0]；

GAPDH，5 [0] TGGACCTGACCTGCCGTCTA3 [0]/5[0] CCC TGTTGCTGTAGCCAAATTC3 [0]。

使用QuantStudio5实时PCR系统（Thermo-Fisher Scientific，美国麻萨诸塞州沃尔瑟姆）对样品进行分析。

SNP分析

使用QIAcube系统（Qiagen，Hilden，德国）从血液中提取DNA。根据对牛皮癣和SNP之间的关联或对生物制剂的反应的文章的大量综述，选择SNP。使用NGS TruSeq Custom Amplicon试剂盒和MiSeq平台（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚，美国），通过靶向测序对SNP面板进行了分析。SNP和补充的SNP一起列在补充材料的表S1中，这些SNP在被研究的基因组区域附近。通过读取深度> 50X和等位基因频率> 0.3选择阳性检出。在hg19上使用ANNOVAR验证了变体的注释。