小分子化合物pull down实验技术介绍一、技术概述小分子化合物Pull-down实验是一种基于亲和层析的分子互作研究技术，通过将小分子化合物共价偶联至固相载体（如磁珠、琼脂糖微球），从复杂生物样本（如细胞裂解液、组织提取物）中特异性捕获与其结合的靶蛋白，结合质谱（MS）或Western Blot（WB）进行鉴定与分析。该技术广泛应用于药物靶点发现、毒性机制研究及信号通路解析，为小分子药物的开发与优化提供关键数据支持。二、实验目的

本实验采用生物素标记的化合物，钓取细胞中与该化合物相互作用的蛋白（靶蛋白），再结合质谱或WB实验进行验证。

三、实验流程

1、生物素标记目标化合物（客户提供标记好的化合物）

2、链霉素亲和磁珠与生物素标记的化合物结合

a. 颠倒混匀磁珠，并转移30ul磁珠到一个新的EP管中

b. 将EP管置于磁力架上静置约1min，进行磁性分离；

c. 吸除上清，并加入60ul A液重悬磁珠，然后进行磁性分离；

d. 吸除上清，并加入30ul B液重悬磁珠，然后进行磁性分离;

e. 吸除上清，并加入30ul C液重悬磁珠，然后进行磁性分离;

f. 重复步骤5；

g. 吸除上清，并加入30ul 1X 生物素 Capture Buffer重悬磁珠;

h. 加入50pmol 生物素标记的化合物，并吹打混匀；

i. 室温旋转孵育30min

3、样本前处理

a. 用1ml 4℃的RLN 悬浮细胞,冰上孵育５min;

b. 1450 ×g, 4 ℃ 离心２min，去上清；

c. 用100ul预冷的RLN洗涤１次（不能悬浮沉淀）；

d. 用100ul预冷的protein lysis buffer重新悬浮细胞（超声2s停4s；10次）；然后涡旋30s，并吹打混匀；

e. 冰上孵育30min；

f. 17000×g, 4℃，离心15min；

g. 转移上清到一个新的EP管备用。

4、磁珠复合物与蛋白结合

a. 把预处理好的磁珠，放置到磁力架上进行磁性分离；

b. 吸除上清，并加入30ul C液重悬磁珠，然后进行磁性分离;

c. 重复步骤2；

d. 吸除上清，加入100µL of 1X Protein-化合物 Binding Buffer 重悬磁珠；

e. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；

f. 吸除上清，并加入100ul 按下表配制的反应体系的mix重悬磁珠：

序号试剂体积（ul）110X Protein-化合物 Binding Buffer10250% glycerol303细胞裂解液304Nuclease-free water30

g. 4℃旋转孵育30min；

5、洗涤与洗脱

a. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；

b. 吸除上清，加入100µL 1X wash buffer重悬磁珠；

c. 重复步骤1与2两次；

d. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；

e. 吸除上清，加入50ul Elution buffer,重悬磁珠；

f. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；

g. 转移上清到新的EP管中，即为pull down 产物；

h. 向 pull down产物中加入13ul loading buffer,并于沸水中水浴10min。

i. 产物进行后续质谱检测

四、技术优势

✅ 高特异性

✅ 广泛适用性

✅ 高灵敏度

✅ 多维度分析

四、适用范围

1️⃣ 药物研发

2️⃣ 信号通路解析

3️⃣ 天然产物功能研究

4️⃣ 环境毒物靶标鉴定

六、代表性实验结果

七、客户提供1细胞样品＞4×107；动物组织＞100mg（黄豆粒大小）；植物组织＞5g2物种信息及基因信息；如后期进行WB实验需自行提供目的蛋白抗体

（注：组织样品需液氮速冻、保存于-80度，样品使用干冰寄送）

如您希望进一步了解该实验的技术细节、数据展示或定制化服务，欢迎联系我们的科研服务团队！