荧光素酶检测实验介绍
一、技术概述
荧光素酶报告基因检测是一种基于生物发光的分子生物学技术，通过将目标基因启动子或调控序列与荧光素酶基因连接，利用荧光素酶催化底物（荧光素）发光，实时或定量检测基因表达活性，广泛应用于转录调控、信号通路分析及药物筛选等领域。
二、实验目的
本实验通过构建含目标调控序列的荧光素酶报告质粒，转染至细胞后，检测荧光素酶活性，从而评估特定转录因子对目标基因的调控作用，或筛选影响基因表达的化合物。
三、实验流程
（一）转染及荧光素酶活性检测
（1）转染体系(每孔)
试剂用量Hieff TransTM试剂0.45 ul报告基因载体0.15盎司Vecfoxo30.25ul无血清DMEM20ul
（2）转染程序
① 转染前一天，将细胞用胰酶消化铺96孔板，控制第二天细胞汇合度约为70~80%
② 将Hieff TransTM、报告基因载体、VecFOXO3、无血清培养基平衡至+15~25℃；
③ 对于每孔用10ul无血清培养基稀释0.15ug报告基因载体，用10ul无血清培养基稀释0.45ul Hieff TransTM试剂,并在室温孵育5min;
④ 轻轻涡旋载体溶液，并逐滴添加稀释的Hieff TransTM试剂，充分混匀后，室温静置 10~25 min以形成 DNA-Hieff TransTM复合物；
⑤ 对于每孔用3ul无血清培养基稀释0.3ul Hieff TransTM试剂,并在室温孵育5min;
⑥ 轻轻涡旋溶液，并添加0.25ul VecFOXO3，充分混匀后，室温静置 10~25 min以形成 RNA-Hieff TransTM复合物；
⑦ 96孔细胞培养板每孔换成80ul无血清培养基;并将复合物逐滴加入孔中，边加边摇晃；
⑧ 37℃，5% CO2培养箱培养24-48h，直至进行转基因表达分析，无需去掉复合物或更换培养基。但对于脆弱的细胞，可能有必要在6h后更换成完全培养基，不会降低转染活性
（3）荧光素酶检测
① 将荧光检测仪打开，设定参数测定时间为10s，测定间隔为2s；
② 裂解细胞：对于贴壁细胞，96孔板培养板吸尽细胞培养液，加入100ul细胞裂解液，轻轻旋转培养板使裂解液完全覆盖细胞,冰上孵育5 min，充分裂解细胞；
③ 配制萤火虫荧光素酶反应工作液和海肾荧光素酶反应液，即萤火虫荧光素酶底物（50 X）和海肾荧光素酶底物（50 X）分别用对应的缓冲液稀释至1 X 工作液。并孵育至室温；
④ 取20 μL细胞裂解液，加至黑色酶标板中。⑤ 加入100 μL 萤火虫荧光素酶反应液，震板混匀，检测萤火虫荧光素酶的活力，
⑥ 加入100 μL 海肾荧光素酶反应液，震板混匀，静置10min后检测海肾荧光素酶的活力；
（二）数据统计分析及处理
检测值比值ratio=萤火虫荧光素酶检测值 / 海肾荧光素酶检测值；
四、技术优势
✅ 高灵敏度：生物发光信号无背景干扰，检测下限低至单细胞水平
✅ 高通量：适用于96/384孔板，可快速筛选大量样本或化合物
✅ 动态范围广：发光信号与酶活性呈线性关系，覆盖宽浓度范围
✅ 灵活性高：可结合多种实验设计（如双荧光素酶系统、药物处理等）
四、适用范围
1️⃣ 转录因子活性检测（如NF-κB、STAT3等信号通路研究）
2️⃣ 启动子或增强子功能分析
3️⃣ 药物或小分子化合物对基因表达的调控研究
4️⃣ 基因编辑（CRISPR/Cas9）后调控效应评估
六、代表性实验结果
七、客户提供
1细胞类型（贴壁或悬浮细胞）,建议提供细胞培养条件2实验设计需求（如药物浓度梯度、处理时间、对照设置等)3目标序列信息（提供待研究调控元件的DNA序列或GenBank编号)
（注: 若需质粒构建服务，请提前联系并提供序列信息；细胞样品需无菌处理，建议使用干冰寄送。）
如您希望进一步了解该实验的技术细节、数据展示或定制化服务，欢迎联系我们的科研服务团队！
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广州如期生物技术有限公司成立于2016年，始终以探索科学、服务客户为己任；致力于为高校、科研院所、医院、制药企业提供全面、便捷、专业的技术服务和产品。技术方面我们专注于生物医学领域：公司拥有完善的技术服务平台，覆盖分子生物学，转录组学、代谢组学、蛋白组学，表观遗传等多个科研平台。在产品方面，自主研究多种类型科研试剂盒20多项，如：COIP、CHIP、RIP等科研检测试剂盒，较之同类型的进口试剂盒，极大的降低了科研成本。
