结构是功能的基础，对结构进行解析有助于探究其作用机制。近年来，冷冻电子显微镜（Cryo-EM）在研究生物大分子结构方面取得了突飞猛进的发展，在生物学领域的应用越来越受到重视，逐渐成为一种被普遍接受的公认的研究生物大分子的有效研究手段，成为连接生物大分子和细胞的纽带和桥梁，为基于结构的药物发现领域带来了新的突破。
冷冻电子显微镜的结构
冷冻电子显微镜的仪器结构与透射电子显微镜的基本结构相似，只是在进样之前搭载了液态乙烷罐与冷冻仓，保证在样品快速冷冻后能够即刻转移至样品仓内。
冷冻电镜发展过程
冷冻电子显微镜技术（cryo-electron microscopy）是在20世纪70年代提出的，早在20世纪70年代科学家们就利用冷冻电镜研究病毒分子的结构，首次提出了冷冻电镜技术的原理、方法以及流程的概念。
到了20世纪90年代，随着冷冻传输装置、场发射电子枪以及CDD成像装置的出现，冷冻电镜单颗粒技术出现。
21世纪初，冷冻电镜技术进一步发展，利用三维重构技术获得了二十面体病毒的三维结构，但此时冷冻电镜的分辨率水平依然没有得到突破，这限制了冷冻电镜在生物大分子领域的应用。
然而2013年12月5日，美国加州大学旧金山分校副教授程亦凡与同事David Julius两个实验室合作，采用单电子计数探测器，以近原子分辨率（3.4Å），确定了在疼痛和热知觉中起中心作用的一种膜蛋白TRPV1的结构，这一振奋人心的成果让研究人员们开始重新审视冷冻电镜在结构生物学研究中的所能发挥的作用。毕竟和X射线晶体学方法相比，它所需的样品量很少，也无需生成晶体，这为一些难结晶的蛋白质的研究带来了新的希望。蛋白质TRPV1结构的确定标志着冷冻电镜正式跨入“原子分辨率”时代。
实验流程
1. 蛋白样本
包括蛋白的表达、纯化过程。
2. 负染检测及评估
一种简单快速的评价样本质量的方法。将重金属染色剂应用于样本，增强对比度，可以快速可视化地进行样本质量初步评估。这一步骤中主要评估样 本的均匀性（蛋白/复合物状态）、分散性、蛋白质/复合物的大小和形状、蛋白质浓度（观察颗粒分布情况）。
3.冷冻制样及评估
在制备冷冻样品之前应确保样品经过完备的生化提纯过程，以具备较低的结构异质性；同时还要保证蛋白分子活性。冷冻制样通常将微量样本 （3-5μl）交由Vitrobot进行处理，制备出一层极薄的分子溶液层，并由液乙烷快速冷冻。冷冻后，样品中的水分子不会形成结晶冰 ，而会形成无定 形（玻璃状）冰层。此时样本分子将较好地分布在冰层中。在开始采集数据前，仍需对冷冻样品进行诊断评估，包括蛋白浓度、分布、稳定性，冰层的质量、厚度、均匀度和载网的均一性。
4. 数据采集、处理
高度稳定的200kV及300kV冷冻电镜提供高通量、自动化的数据收集。这一过程中透射电镜将采集数万张至数百万张高分辨率单颗粒图片，并由特定 的算法程序进行数据整理。
5. 三维重构、模型建立
大分子的三维重构依赖于对数以万计的颗粒图片进行平均，这个过程中数据需要经过多步处理，需要调用适当的计算资源。在分析结构前，需要进行 完好的数据基础存储架构，用来支持可生成TB级数据的冷冻电镜设施。三维重构的核心是软件算法，可用于测定及整合每一张照片的诸多参数如空间 取向，而后才能将二维的图片整合重构为三维的模型。
优势与不足
优势：
快速冷冻制样处理，可使样本保持近自然水合状态
允许检测同一靶蛋白的多种构象
无需结晶，可解析业界难点膜蛋白
可解析大型蛋白复合物的结构
微克级样品需求，对蛋白纯度耐受性高
不足：
（1）样品制备的困难。样品制备的关键要求是颗粒朝向必须是随机分布的，但样品制备过程操作会对颗粒的随机分布造成影响。
（2）要求样品结构均一性。多个颗粒的图像数据必须进行合并和平均以形成3D重构图，若要实现高分辨率，就必须保持样品结构的均一。
（3）蛋白颗粒构象多样。理论上说，单颗粒冷冻电镜的一大优势就在于能区别不同的功能构象，但是有时候不同的构象相似度太高，导致区别起来非常棘手。
（4）成像理论需要进一步研究。冷冻电镜现有的成像理论是一种数学上的近似法。如果要进一步提高结构解析的分辨率，就需要用到更为复杂的电镜成像理论来提取图像。近年来，在单颗粒分析中取得重大突破的是最大似然估计理论，它在图像匹配、2D和3D分类与模型优化上均有应用，是一个强有力的理论工具。但过多的计算资源消耗阻碍了这个方法在冷冻电镜单颗粒重构中的广泛应用，如何在加快计算速度的同时，提高模型重构的准确性是最大似然估计算法的一个重要问题。
Cryo-EM在结构生物学的应用
案例1：2019-nCoV病毒
从历史维度上看，冷冻电镜技术在结构生物学领域的功勋建树无需赘述。2020年新型冠状（2019-nCoV）病毒疫情席卷全球，冷冻电镜技术在解析病毒结构、推测其侵染人体细胞的路径等传播原理发挥了重要作用。
病毒要进入人体细胞，就必须与人体细胞上相应的受体蛋白结合。新冠肺炎疫情暴发以来，新冠病毒表面与宿主细胞作用的关键刺突蛋白（S蛋白，Spike glycoprotein）备受各研究团队的重视。得克萨斯大学的McLellan研究组采用冷冻电镜技术，获得纯化S蛋白的3207张照片，结合已经公开的新冠病毒序列，获得了经过3D重建的分辨率为3.5 Å的S蛋白三聚体结构。
图1. 2019-nCoV病毒与SARS病毒的结构比较
研究团队将新冠病毒的结构与其他几种冠状病毒进行了比较。如图1，发现2019-nCoV的S蛋白整体结构与SARS病毒S蛋白的整体结构相似，各个结构之间具有高度同源性。它们之间最大的差异是RBD在其各自的“向下”结构中的位置差异。
结合冷冻电镜获取的病毒结构与表面等离子共振技术（SPR）的分析结果，研究团队表明，新冠病毒的S蛋白结合人体ACE2（宿主细胞受体血管紧张素转化酶2）的亲和力要远高于严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）的S蛋白，这解释了为什么新冠病毒传染性要比SARS病毒强得多。
参考文献：Wrapp D , Wang N , Corbett K S , et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation[J]. Science, 2020, 367(6483):eabb2507.
案例2：生命剪接体
Cryo-EM别适用于解析难以结晶的大分子复合物的高分辨率三维结构。通过在近生理状态下观察蛋白质和其他生物大分子，Cryo-EM 揭示了它们的功能和动态变化。如图2所示，中国科学院院士施一公教授团队利用冷冻电镜技术得到了关于近原子分辨率的生命剪接体三维结构。
图2. 利用冷冻电镜解析的生命剪接体三维结构
参考文献：Ruixue Wan,et al. Structure of a yeast catalytic step I spliceosome at 3.4-angstrom resolution[J]. Science, 2016, 353(6302):895-904.
案例3：GCGR蛋白
2020年，在Science上发表了一篇G蛋白偶联受体（GPCR）-GCGR蛋白的结构信息，该蛋白的结构解析工作由青云瑞晶的技术人员完成。
G蛋白偶联受体（GPCR）属于膜蛋白，膜蛋白的膜内区域具有广泛的疏水表面，从膜上解离下来后在极性的水溶液中难以稳定存在，往往无法使用常规的结晶方法获得其结构信息。该研究通过冷冻电镜单颗粒法解析了GCGR与其同源配体胰高血糖素和异源三聚体Gs或Gi1蛋白的结构，以研究GCGR与G蛋白相互作用的分子机制。
图3. Glucagon-GCGR–G蛋白复合物的整体结构(A, B) glucagon-GCGR-Gs-Nb35复合物的结构，分辨率为3.7 Å; (C, D) Glucagon-GCGR-Gi1-scfv16复合物的结构，分辨率为3.9 Å
参考文献：Qiao A, Han S, Li X, Wootten D, Sun F, Zhao Q, Wu B. Structural basis of Gs and Gi recognition by the human glucagon receptor. Science. 2020 Mar 20;367(6484):1346-1352.
Cryo-EM 结构解析技术平台
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