蛋白质分离纯化是一个从细胞裂解液或组织中提取并纯化目标蛋白的复杂过程。这一过程需要通常根据蛋白质的大小、溶解度、带电性等性质的不同，采用不同的纯化策略。
纯化策略举例
破碎→亲和层析（粗提纯）→标签切除→二次亲和层析→凝胶过滤层析→超滤浓缩
步骤说明
01
高压低温匀浆破碎
收获细胞后，通过液体剪切作用来大规模破碎细胞，收获细胞物质以用于后续纯化。
02
实验室常用层析技术
蛋白纯化方法通常采用层析的方式进行，目前常用的层析方法主要有以下几种：
1）
亲和层析(AC)
亲和层析是一种基于特定相互作用的纯化方法。在这种方法中，目标蛋白通过与固定在层析柱上的特定配体（如抗体、核酸或小分子）的亲和力结合而被分离。具有高选择性、高纯度、快速等特点，通常在重组蛋白的分离中作为第一步的粗提纯，对大部分杂质蛋白进行去除。
特点：
高度选择性：亲和柱和配体的选择性很高，能够特异性地结合目标蛋白质；
灵活性好：可以根据不同的亲和配体选择不同的亲和柱，适用于各种不同的蛋白质；
相对简便：相对于其他纯化方法，亲和层析的操作相对简单，适用于实验室和工业生产；
高效率：亲和层析可以在一步操作中实现高纯度和高回收率的纯化。
在实际蛋白纯化中，通常会利用添加特定标签（如His-tag）的方法，使目标蛋白与配体发生特异性相互作用。
表1. 目前常用纯化标签（部分）
2）
凝胶过滤层析(GFC)
又称为分子筛（SEC）或排阻层析。根据被分离样品中各组分相对分子质量大小的差异进行洗脱分离。操作条件比较温和不需要有机溶剂。凝胶过滤层析一般用于最后一步纯化。
特点：
设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高；
GFC使用的凝胶介质不带电荷，与溶剂（流动相）之间没有直接相互作用，具有良好的稳定性，分离条件温和，因此对蛋白质活性没有不良影响。
适用范围广：GFC适用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质。它能够分离不同分子量的样品，甚至可以将分子大小相差25%的样品完全分开，只需使用单一凝胶床
脱盐操作方便；
缺点：分辨率不高，对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。
3）
离子交换层析(IEC)
不同蛋白具有不同的等电点，当其在不同pH缓冲液条件下时所带的电荷不同，可根据蛋白带电性质选择不同的离子交换柱。过程可逆、操控性强，在精纯步骤中常与其他方法结合使用。IEC最常见的应用是精纯目标分子，但也可以用来捕获如病毒载体等产物。
特点：
灵活性好：IEC层析可以根据需要减少或消除稀释或调整步骤，使其适应不同的处理条件；
高生产率：即插即用型的IEC整体柱层析组合可以满足高速处理需求，而不会牺牲容量；
适用于蛋白质、多肽和核酸等生物产物的主要纯化方法。
4)
疏水作用层析(HIC)
根据生物分子疏水性质实现纯化的一种层析方法，在高离子强度下，增进蛋白质与层析介质间疏水作用力，实现吸附；在降低流动相离子强度时，蛋白质分子与层析介质疏水作用削弱，目的蛋白即可洗脱和收集。
特点：
可以在温和的条件下进行，不需要有机溶剂或极端的pH值，因此可以保持蛋白质的活性和稳定性。
可以有效地去除蛋白质的聚集体，提高产品的纯度和安全性。可以与其他层析技术（如离子交换层析或凝胶过滤层析）相结合，实现更高的分辨率和回收率。
可以用于大分子蛋白（如病毒、病毒样颗粒或核酸）的捕获和纯化，因为它没有尺寸排斥效应。
03
标签切除
在蛋白纯化过程中，标签的去除与否取决于标签的类型和目标蛋白的应用需求。
非干扰性标签：如His-Tag，通常不需要去除，因为它不影响蛋白的功能和下游应用。
干扰性标签：如GST-Tag和Mbp-Tag，这些标签可能较大，会干扰主蛋白的结构和功能，因此纯化后通常需要去除。特别是Mbp-Tag，其分子量较大，可能会影响蛋白的功能和下游实验的应用，因此纯化后通常需要去除。
标签去除步骤：
①蛋白裂解：如果需要去除标签，可以使用蛋白裂解酶，将标签切除。
②二次亲和层析：将裂解液经过二次亲和层析，使用未结合的标签结合亲和树脂，以去除剩余的标签。
04
超滤浓缩
蛋白质在制备过程中由于过柱纯化而使样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。
超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，液体在一定压力下通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留。具有成本低、操作方便、条件温和、蛋白质活性保持较好、回收率高等特点，是目前最适用于蛋白质的浓缩或脱盐的手段。
总结
纯化技术的选择与组合是对蛋白质进行成功纯化的关键，在实际操作中，需要根据目标蛋白的性质和实验目的，选择合适的纯化方法，通过多步纯化，最终获得高质量的目的蛋白。
随着生物技术和生物医学领域的快速发展，对高质量蛋白质样品的需求不断增加，蛋白纯化技术也在不断创新。「青云瑞晶」提供专业的结构解析服务。我们的技术团队可制备纯度极高的符合结晶条件的重组蛋白产品，并根据您的项目需求设计合适的试验方案，帮助您的项目获得更好的实验数据。
