准噶尔部的崛起不仅导致了叶尔羌汗国的崩溃，更如同与历代中原王朝对峙的草原游牧帝国一样，成为清朝的心腹大患。

噶尔丹在征服塔里木盆地后，于康熙二十六年（1687）举兵越过杭爱山，进攻喀尔喀蒙古，各部一触即溃。康熙二十九年（1690）七月清军与准噶尔军会战于乌兰布通，战后噶尔丹退往科布多，仍伺机再举。

为了更有效地与之对抗，清政府开始积极争取处于准噶尔部殖民统治下的西域回部政权加入自己阵营，其首要目标便是毗邻中原的哈密、吐鲁番地区。

早在康熙三十一年（1692）八月，清政府派遣理藩院员外郎马迪出使伊犁地区，与策妄阿拉布坦联络共同反对噶尔丹，结果在哈密遭遇噶尔丹所部袭击，马迪遇害，使团其他成员在哈密回部首领额贝都拉的帮助下返回嘉峪关。

消息传至北京，清圣祖没有听从朝臣惩罚哈密的意见，而是抓住机会进行拉拢，并释放了当时被拘禁于甘州的哈密回人以示善意。

康熙三十五年（1696），噶尔丹于昭莫多大败，有生力量基本被歼灭，而此时伊犁故土又被其侄策妄阿拉布坦占据，一代草原枭雄从此一蹶不振，流离失所，次年暴死于阿查阿穆塔台，历时近十年的噶尔丹之乱终于落下帷幕。噶尔丹失势后，久受其压迫之苦的额贝都拉趁机遣使朝贡，以求获得清朝保护。

康熙三十六年（1697），额贝都拉擒获噶尔丹之子色布腾巴勒珠尔，后不顾策妄阿拉布坦以武力威逼索要，将之献于清政府，并上表请求赐予“敕印”，“俾有恃无恐，以保我疆土”，正式归附清朝。

清圣祖立即完全应允其请求，封额贝都拉为“扎萨克一等达尔汉”，确立其世袭统治者的地位，并仿照蒙古例将其部众编为扎萨克旗，哈密从此成为清朝藩部。

噶尔丹死后，其继任者策妄阿拉布坦在较长时间内与清朝维持了相对和平的关系，双方没有大的武装冲突。不过，康熙五十五年（1716），策妄阿拉布坦趁西藏局势动荡出兵攻陷拉萨，杀死西藏统治者、和硕特部的拉藏汗，夺取了当地政权。

准噶尔部控制西藏便可以挟持达赖喇嘛以号令众蒙古，这是清朝所绝对不能容忍的。康熙五十九年（1720），清军由青海、四川两路入藏，另有两路则由阿尔泰、巴里坤直趋准噶尔本土以为牵制。

同年，清军进入吐鲁番盆地，统治当地的回部上层宗教势力发生为是否归顺清朝发生分歧。后来赫赫有名的回疆大封建主霍集斯伯克的父亲阿济斯和卓西奔准噶尔，而时任辟展城伯克的额敏和卓及其统治鲁克沁地区的两个哥哥则向清军投诚，于是继哈密之后吐鲁番也被纳入清朝疆域。

雍正七年（1729），清军两路进军伊犁，清准战争爆发。在战争期间，吐鲁番盆地成为清军重要的前进基地和后勤中心，额敏和卓等率领回众屯田种地，抵抗准噶尔军袭扰，为清朝出力不少，屡获雍正帝褒奖。

然而，清准战争的进展远不如雍正帝预想的那么顺利，准噶尔部因策妄阿拉布坦病逝而内讧瓦解的情况并没有出现，噶尔丹棱策牢牢掌握了汗国的政权，与清军互有胜负，战争陷入了代价巨大的消耗战，双方均感到力不从心。

在此情况下，为收缩防线，清朝不得不放弃了吐鲁番盆地，于雍正十年（1732）将额敏和卓所部迁往甘肃瓜州安置。此后清准议和划界，清朝固守哈密，如川陕总督尹继善乾隆七年奏：“哈密为西陲要隘，塞外藩篱。若狡虏生心，必先犯哈密。设兵驻守，虽用以卫回民，实资以固门户也。”

曾是中亚“伊斯兰世界”一部分的哈密成为清朝的边镇前哨，更是中原与中亚之间的交通往来所必经的枢纽，仅每次准噶尔使团、商队依照和约前往内地朝贡、贸易时在哈密变卖病弱牲畜的交易额既达一万余两白银，当时繁荣热闹的景象不难想见。

而且在经哈密前往内地贸易的商人中很可能不仅包括准噶尔商人，以及在准噶尔部统治下的天山南路回部商人，还包括来自河中乃至中亚更西部地区的商人。

正如佐口透所指出的：“准噶尔洪台吉们为了全力征收和输送贡赋的需要，由中亚突厥商人积极参与的，往返于准噶尔王国、俄罗斯、哈萨克草原和清朝之间的远途贸易，以及中断了很久的中央亚细亚的东西方中继贸易又重新活跃起来了。布哈拉汗国在这样的中继贸易中异常活跃，其中特别是布哈拉、塔什干的商人，以及东突厥斯坦的喀什噶尔、叶尔羌的商人”。

而在交易的商品中，尤以中国出产的大黄、茶叶特别突出，清政府也利用这一点，就如同宋、明以开放互市与否当作对付蒙古的重要手段一样，以贸易为武器与准噶尔斗争。

哈密在中亚贸易中的这种特殊地位，甚至一直保留到清朝统一新疆之后：据米华健的考察，哈密是新疆内部唯一征收过境贸易税的城市。