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3D生物打印是一种以分层方式制造含有细胞的生物构造物的方法。挤压生物打印技术基于在构建板上按程序沉积含有细胞的生物墨水，由于其简单性，是各种生物打印模式中最普遍、最廉价的技术。挤压生物打印技术发展的关键瓶颈之一是缺乏生物相容性好且可打印的生物墨水。具体来说，许多生物相容性水凝胶都不具备足够的机械和流变特性，无法进行3D生物打印。解决上述挤压生物打印局限性的策略是使用支持浴对低粘度材料进行生物打印，以保持高形状保真度。这种方法一般称为嵌入式3D生物打印，于 2011 年问世。嵌入式3D生物打印技术的出现彻底改变了利用低粘度和慢交联水凝胶进行自由形态构建的生物制造技术。使用基于凝胶的支撑浴有其局限性，包括缺乏适当的氧气和营养以及移除浴时的并发症。

来自加拿大蒙特利尔大学的Sophie Lerouge和Ali Ahmadi团队开发了一种新型的嵌入式3D生物打印技术，以白蛋白泡沫支撑浴作为有前途的替代品。所提出的泡沫内生物打印技术具有出色的打印适性和洗浴去除的便利性，同时为细胞提供易于获取氧气和营养物质的机会。通过泡沫稳定性和流变学测试，对基于泡沫的支持浴进行了表征。通过测量泡沫中的气泡大小，可以研究气泡随时间凝聚导致的浴液结构变化。使用热致伸缩性壳聚糖基生物墨水成功进行了自由形态结构的3D打印，展示了泡沫内生物打印技术的能力。对生物打印成纤维细胞 L929 的存活率进行了为期七天的研究，结果显示细胞存活率高达 97% 以上，这归功于泡沫支撑浴中丰富的氧气和营养。重要的是，泡沫内生物打印有利于在不影响细胞存活率的情况下，用较长的打印时间制作大型样品。相关工作以题为“In-Foam Bioprinting: An Embedded Bioprinting Technique with Self-Removable Support Bath”的文章发表在2024年01月31日的国际知名期刊《Small Science》。

1. 创新型研究内容

本研究开发了一种泡沫内生物打印技术（图 1），这是一种生物制造方法，其基础是使用白蛋白泡沫作为支撑浴，在生物相容性环境中将低粘度慢交联水凝胶制成自由形态结构。本研究测试了不同浓度的白蛋白和不同的发泡时间，以确定产生泡沫的最佳实验条件。对泡沫的流变学和物理特性分析表明，泡沫中的气泡在制作用于生物打印的自移除基底时发挥了重要作用。与传统的支撑浴相比，本研究已经证明，在嵌入式生物打印中使用泡沫支撑浴的独特优势在于气泡能够在生物打印后合并，从而形成牺牲型支撑浴。作为概念验证，泡沫内生物打印技术被用于使用壳聚糖基热敏水凝胶进行各种结构的生物打印，由于壳聚糖基热敏水凝胶粘度低、凝胶时间长，因此无法使用传统的生物打印模式进行打印。以 L929 成纤维细胞为模型细胞，证明了该工艺的细胞兼容性。研究结果证明，泡沫内生物打印技术可用于制造复杂的含有细胞的结构，并可应用于组织工程和疗养技术。

图1 泡沫内生物打印工艺示意图

【流变学分析】

理想的支撑浴必须在生物打印期间保持稳定。它必须能够在生物打印机喷嘴移动后恢复其原始状态和流变特性，如存储模量。首先对白蛋白支持浴组（即含有不同浓度白蛋白的泡沫）进行表征，通过时间扫描测试评估它们在生物打印温度（即 37℃）下的稳定性。此外，还研究了它们在 37℃ 下的剪切稀化和恢复行为。图 2 展示了发泡时间为 2 分钟（左图）或 4 分钟（右图）时的主要流变测试结果。图 2A 显示了各种浴液在机械发泡 2 分钟后随时间变化的储存模量。所有泡沫成分的储存模量都随时间缓慢下降。不过，与浓度为 4% w v-1 的白蛋白相比，浓度为 12% 和 8% w v-1 的白蛋白更稳定。在 30 分钟内，G′从≈280 Pa 下降到 220 Pa，即白蛋白浓度为 12% 时下降 21%；白蛋白浓度为 8% 时从≈250 Pa 下降到 180 Pa，即下降 28%；白蛋白浓度为 4% 时从≈270 Pa 下降到 140 Pa，即下降 48%。这种储存模量的下降可以解释为气泡随着时间的推移而合并和凝聚。如图 2B 所示，当发泡时间增加到 4 分钟时，所有配方的 G′都较高。发泡时间越长，泡沫液相中展开的白蛋白越多。这种现象导致发泡 4 分钟的样品气泡更硬，G′也更高。随着时间的推移，较硬泡沫的崩溃导致 4 分钟发泡白蛋白的储存模量急剧下降。这些样品的贮存模量降低了≈65%，这表明虽然增加发泡时间会提高贮存模量，但贮存模量的稳定性会受到负面影响，这在嵌入式生物打印中并不可取。结论是 2 分钟的机械发泡足以产生稳定的泡沫。

图2 白蛋白支撑浴的流变特性

【泡沫大小】

随着时间的推移，泡沫中的气泡逐渐融合，并随着液体和气体之间的相分离而逐渐消失。图 3A 显示了从各种泡沫中捕捉到的气泡显微图像，图 3B 显示了气泡直径的直方图。在所有泡沫成分和发泡时间下，气泡的大小分布相似，大多数气泡的直径在 50 到 150 微米之间。如图 3C 和 D 所示，平均气泡大小随着时间的推移而增大，直到大气泡开始破裂。白蛋白泡沫的这种行为解决了传统嵌入式生物打印方法中长期存在的浴槽移除问题。这一特性使用户能够进行精细结构的生物打印，而不会在交联和水浴移除过程中危及结构的保真度。

【泡沫稳定性】

机械发泡后气泡凝聚，导致泡沫内的相逐渐分离。白蛋白浓度和发泡时间是本研究调查的两个主要因素，因为它们会影响相分离的速度。如图 3E、F所示，随着时间的推移，所有研究组的液相都逐渐向下流动。虽然白蛋白浓度较低的研究组往往稳定性较差，但差异在统计学上并不显著。有研究表明，白蛋白泡沫的稳定性与溶液的 pH 值有很大关系，多糖等添加剂可用作稳定剂来提高白蛋白泡沫的稳定性。为了证实多糖对泡沫稳定性和气泡大小随时间变化的影响，将 2% 的海藻酸钠和 8% 的白蛋白溶液进行发泡，并在 2 小时内进行观察。为了证实多糖对泡沫稳定性和气泡大小随时间变化的影响，将 2% 的海藻酸钠和 8% 的白蛋白溶液发泡并观察 2 小时。100 分钟后，测得气泡的平均大小为 323 ± 9 μm，比未添加稳定剂的 8%白蛋白泡沫小 2.75 倍。然而，由于这种方法的自移除特性取决于气泡的凝聚，因此在理想情况下，泡沫的稳定性应根据打印时间进行调整。这种调整将防止重力可能造成的任何负面影响。

图3 细胞培养基中白蛋白泡沫的物理特性

【可打印性】

通过3D打印几种由慢交联壳聚糖或壳聚糖-胶原蛋白水凝胶制成的构造物，检验了泡沫内嵌入打印工艺的可行性。如图 4A 所示，泡沫内打印方法被成功用于制造从网格图案到自由形式锥形结构的各种构造。图 4A 还展示了白蛋白泡沫的一个固有缺点，即由于光衍射，生物打印过程不可见。为了突出使用泡沫作为支撑槽的重要性，本研究尝试在没有泡沫的情况下打印网格结构（图 4B）。这次失败的打印工作表明了支撑浴在打印壳聚糖和壳聚糖-胶原蛋白过程中的重要作用。生物打印后，随着时间的推移，泡沫的两相逐渐分离，而样品则在 37 ℃ 下慢慢凝胶化（图 4C）。泡沫中气泡的凝聚导致泡沫逐渐消失，但不会影响嵌入细胞的活力。由于泡沫本质上是由气泡组成的，因此大部分剩余泡沫（如果有的话）很容易通过负压去除。这种方便的支撑浴去除方法是泡沫内打印方法的最大优点。然而，由于白蛋白带负电荷，在打印结构上可以观察到白蛋白的痕迹，这使得带正电荷的壳聚糖样品表面变得粗糙。不过，白蛋白残留物也会影响打印结构的生物相容性，因此今后需要使用人血白蛋白而不是鸡血白蛋白。经计算，打印网格结构的可打印性（Pr）数为 0.87 ± 0.03。值得注意的是，样品上残留的白蛋白对使用 Pr 数（Pr = L2/16A，L：周长，A：方格面积）等方法计算泡沫内生物打印结构的特性有不利影响。不过，无论是使用壳聚糖生物墨水还是壳聚糖-胶原蛋白生物墨水打印的样品，其整体分辨率在视觉上都是可以接受的，与其他嵌入式生物打印方法不相上下。

图4 泡沫内打印性

【细胞活力】

本研究首先进行了细胞存活率研究，以了解在营养丰富的泡沫浴中进行生物打印时，细胞在壳聚糖-胶原蛋白构建体中的存活时间。在加入细胞培养基之前，需要在生物打印和去除泡沫之间延迟一段时间，以确保样品充分交联，否则生物打印的构建体将会塌陷。在 8%的白蛋白泡沫内部和外部对含有细胞的网格构建体进行生物打印，并在去除过量的泡沫浴后的 30 分钟、240 分钟或 24 小时后加入细胞培养基。对于仅研究泡沫存在对细胞活力影响的对照组，在泡沫外进行生物打印后，在加入培养基前立即加入磷酸盐缓冲盐水（PBS）1×，以避免细胞干燥。图 5A 显示了第 1 天样品的活/死荧光图像。如图 5B 所示，在不加培养基的情况下培养 240 分钟后，对照样品的细胞活力明显下降。不出所料，大部分细胞在饥饿 24 小时后死亡。据观察，对照样品中的细胞更多集中在水凝胶的外围区域。即使在不添加额外细胞培养基的情况下在泡沫中培养 24 小时，泡沫内生物打印样品中存活细胞的百分比也不会受到这种延迟的显著影响。此外，使用泡沫支撑浴时，生物打印细胞可在整个结构中获得适当的氧气，防止缺氧。虽然目前还没有标准的凝胶支撑浴来衡量我们的细胞存活率结果，但对细胞含氧量进行更有针对性的研究，可以阐明与传统凝胶支撑浴中有限的溶解氧水平相比，气相氧的存在所带来的潜在优势。在生物打印过程需要几个小时的情况下，特别是在使用慢交联生物墨水或大型构建体（如完整器官）进行生物打印时，能够长时间保持细胞存活意味着泡沫内方法的另一个优势。

图5 与对照组（无支撑浴）相比，加入细胞培养基前的时间对生物打印壳聚糖-胶原蛋白网格构建体细胞活力的影响

然后是进行为期 7 天的细胞存活率研究，以评估白蛋白浓度（DMEM中分别为 8%和 12%）对壳聚糖-胶原结构包埋细胞存活率的影响。生物打印 30 分钟后去除泡沫并加入细胞培养基。测试了两组没有泡沫的生物打印对照组，其中一组在生物打印后立即加入细胞培养基（阳性对照组），另一组在生物打印后 30 分钟加入细胞培养基（阴性对照组）。分析第 1、4 和 7 天的活/死荧光显微镜图像（图 6）发现，与阴性对照组相比，泡沫内生物打印样品的细胞存活率明显更高。本研究观察到白蛋白的浓度对细胞存活率的影响很小。阳性对照组的细胞存活率与泡沫内生物打印组没有明显差异。然而，在生物打印后立即添加培养基（阳性对照组就是这样做的）并不总是可行，原因有两个：1) 许多生物墨水不会立即交联，因此在添加介质前需要等待一段时间；2) 大型构建体的生物打印可能非常耗时，因此需要延迟添加介质，直到整个构建体完成生物制造。此外，在许多情况下，要获得可接受的打印分辨率，还需要一个支撑浴，不使用泡沫打印的对照网格结构就很糟糕（见图 4B）。这一观察结果完全符合本研究的泡沫内生物打印方法的生物相容性及其为传统生物打印方法增加灵活性和多功能性的潜力。泡沫内生物打印方法的细胞存活率范围与其他嵌入式生物打印方法相当。

图6 对照组和泡沫内生物打印样品 7 天细胞培养的活/死荧光显微镜图像和细胞存活率结果

2. 总结与展望

本研究提出了泡沫内生物打印技术，这是一种新型的嵌入式生物打印模式，其基础是利用非液体支撑浴--白蛋白泡沫。本研究的支撑浴提供了一种生物相容性环境，并具有许多明显的特征。由于泡沫本质上是由气泡构成的，因此生物打印细胞在生物制造和凝胶化过程中不易面临低氧环境。泡沫中丰富的细胞培养基和其他营养物质有望提高细胞活力。此外，泡沫浴可以在生物打印后逐渐移除，而无需任何可能对打印结构的形状保真度产生负面影响的外部机制的干预。泡沫内生物打印方法对于凝胶化时间较短或较长的低粘度水凝胶的生物打印都是可靠而有效的，不会影响细胞活力。此外，使用这种方法还可以生物制造出打印时间较长的大型结构。虽然本研究结果证明了泡沫内生物打印方法的可行性和潜力，但还需要进一步研究使用其他细胞类型来研究细胞的功能，以及使用其他发泡剂作为支撑浴，或添加泡沫稳定剂来增强泡沫的稳定性，以进行嵌入式生物打印。此外，利用泡沫来研究这种方法对采用其他交联方法（如离子交联水凝胶）进行生物打印的适用性也需要进一步关注。这种生物打印技术适用于自由形态构建体的生物制造，可应用于组织工程和精准领域。

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