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主动脉瓣钙化性疾病是一种常见的心血管疾病，目前尚无药物能够有效防止其恶化。高效给药系统可作为药物筛选的重要工具，有助于提高药物调理效果。但是由于主动脉瓣狭窄，导致其血流速度较快并缺乏特异性标记，因此针对钙化性主动脉瓣疾病靶向给药较为困难。近日，来自浙江大学的刘先宝、王建安和Tanchen Ren教授团队进行了磁纳米颗粒靶向PAR2加强主动脉瓣药物递送缓解钙化的相关研究。研究成果以“Enhancing aortic valve drug delivery with PAR2-targeting magnetic nano-cargoes for calcification alleviation”为题于01月16日发表在《Nature Communications》上。
本文发现蛋白酶活化受体2（PAR2）在瓣膜间质细胞质膜上表达增加。因此，开发了功能化磁性纳米载体由靶向PAR2，用于双活性靶向给药。研究表明，该纳米载体能在磁场导航下将抗钙化药物XCT790有效递送到钙化主动脉瓣中。在高脂喂养的低密度脂蛋白受体缺陷（Ldlr-/-）小鼠模型中，纳米载体能有效抑制瓣膜间质细胞成骨分化，缓解主动脉瓣钙化和狭窄。本文结合PAR2和磁靶向技术，为主动脉瓣钙化疾病调理提供一种有效的靶向给药策略，有望在未来实现临床转化。
本文从以下几个方面进行详细描述
1. 成骨分化hVIC和钙化主动脉瓣中PAR2表达增加
2. PAR2阳性细胞促进瓣膜钙化
3. PAR2-配体功能化可增强纳米粒子与骨分化hVIC的结合力
4. 磁引导纳米粒子在hVIC中定位
5. 纳米颗粒可减少hVIC成骨分化
6. 纳米颗粒可靶向作用于小鼠钙化的主动脉瓣
7. 纳米疗法缓解小鼠主动脉瓣钙化
8. 代谢重编程介导的纳米疗法在抗钙化中的作用
9. SR@PFeXCT在体内和体外的生物安全性
图1 实验流程及机制示意图
本文开发了一种用于CAVD的高效给药平台，该平台具有双活性靶向能力，可抑制VICs成骨分化，减轻主动脉瓣钙化并减少不良副作用。PLGA可携带脂溶性药物XCT790，具有良好的生物相容性和可降解性。为进一步提高药物在主动脉瓣中的留存率，研究人员在PLGA纳米颗粒核心镶嵌了MNPs，进而实现循环过程中磁吸引。接着在纳米载体上涂裹聚乙二醇(PEG)，增强其生物相容性并减少巨噬细胞吞噬。纳米颗粒由PAR2六肽配体功能化后，可确保CAVD锚定。静脉注射后纳米颗粒通过磁引导富集到钙化主动脉瓣小叶上。在六肽与PAR2的介导下，纳米颗粒附着在成骨分化的VIC上并被内化。最后，XCT790释放到细胞质中，调节VICs的代谢重编程，抑制VICs的成骨分化和小叶中钙沉积。总之，本文确定了钙化VIC的细胞表面锚定位点，并设计了一种基于表面锚定和磁导航的双重活性TDDS，实现钙化主动脉瓣靶向调理。
图2 成骨分化的hVIC和钙化主动脉瓣中PAR2表达增加
本文筛选了成骨分化后上调的VICs胚胎蛋白作为CAVD TDDSs的靶标。进行分析确定表达上调和下调的分子，使用qPCR证实，成骨诱导后，F2RL1、F2RL2、NPR1、FPR3和CSF2R表达显著上调。NPR1、FPR3和CSF2R在hVICs中表达水平很低。WB进一步证实，随着成骨诱导时间延长，PAR2（F2RL1编码蛋白）的蛋白表达以时间依赖性方式增加，并与成骨分化指标呈正相关。考虑到hVICs肌纤维分化是主动脉瓣纤维化和钙化的另一个主要原因，用TGF-β刺激hVICs诱导肌纤维化。WB结果显示，PAR2蛋白表达在TGF-β刺激下增加。为进一步证实PAR2在成骨分化VIC和体内钙化瓣膜组织中表达上调，研究人员检测了未钙化和钙化主动脉瓣中PAR2蛋白的表达模式，结果也显示钙化瓣膜组织中PAR2蛋白表达明显高于对照瓣膜组织。免疫组化染色评估PAR2在小叶三层结构中的分布，包括主动脉侧富含胶原的纤维层、富含蛋白多糖的海绵层和富含弹性蛋白的心室层。与未钙化小叶相比，PAR2阳性细胞在钙化小叶的三层中都更为丰富，尤其是在纤维层的钙化周围和纤维化区域。为研究PAR2是否在钙化小鼠主动脉瓣中上调，本文建立两种主动脉瓣钙化模型：（1）Ldlr-/-小鼠饲喂高脂饮食（HFD）24周，诱导瓣膜硬化和钙化。（2）野生型小鼠主动脉瓣经颈动脉钢丝损伤，诱导细胞增殖和瓣膜增厚。结果显示与正常饮食相比，PAR2在高密度脂蛋白胆固醇/-小鼠主动脉瓣中的表达明显升高。主动脉瓣叶一侧的PAR2表达高于心室一侧。总之，以上数据表明，PAR2作为一种在主动脉瓣瓣叶钙化和hVIC中上调的膜蛋白，可能是CAVD TDDS的有效靶点。
图3 纳米颗粒表征及其对体外成骨分化hVIC的靶向能力
研究人员为验证PAR2作为纳米载体与钙化瓣膜结合的可行性，采用经FDA批准、具有强大临床转化潜力的材料。PLGA具有较好的生物降解性和相容性，具有表面改性潜力，能较好的负载疏水性药物和纳米颗粒。本文合成了由PLGA、XCT790和10纳米MNPs组成的纳米颗粒核心，并以牛血清白蛋白作为稳定剂。使用配体浓度为0.2 mg/mL，确保较高的肽接枝率。纳米颗粒的粒度分布和zeta电位检测发现：PLGA纳米粒子的平均粒径为147.4±6.3nm，改性后增至186.8±6.9nm，但粒径分布未受影响。可能是由于带负电荷的BSA被神经性更强的PEG所覆盖。扫描电镜（SEM）证实SLIGKV改性、MNPs和XCT790负载纳米颗粒（SK@PFeXCT）的球形结构。为评估纳米颗粒对成骨分化hVICs的靶向能力，合成Cy5标记的纳米颗粒（PFeCy5或SK@PFeCy5）并与成骨分化的hVICs共培养。与PFeCy5相比，SK@PFeCy5与hVICs共定位增加，表明SLIGKV-NH2修饰显著增强纳米颗粒与hVICs的亲和力。此外，成骨分化hVICs捕获的SK@PFeCy5比静止hVICs多5倍，表明用SLIGKV-NH2修饰纳米颗粒赋予靶向成骨分化hVICs的能力。为证实上调PAR2介导了纳米颗粒细胞内化的增加，用PAR2 siRNA转染hVIC并与纳米颗粒共孵育。通过WB验证PAR2的敲除效率。观察到Cy5阳性hVIC数量减少，证实PAR2对SK@PFeCy5靶向能力的重要性。综上所述，以上结果表明PAR2配体功能化增强纳米颗粒对成骨分化和肌纤维分化hVIC的亲和力。
图4 SR@PFeXCT减轻小鼠主动脉瓣钙化
接着在CAVD小鼠模型中评估SR@PFeXCT的调理效果。喂食高密度脂蛋白(HFD)20周后，Ldlr-/-小鼠主动脉瓣上出现斑块。给Ldlr-/-小鼠静脉注射SR@PFe或SR@PFeXCT。调理8周后，超声心动图评估心脏功能和主动脉狭窄情况。运动模式显示，各组之间的心功能无明显差异。同时，多普勒显示，与ND喂养的小鼠相比，HFD组的跨瓣射流速度峰值和跨瓣压力梯度峰值明显更高，表明主动脉瓣狭窄模型成功建立。每周两次腹腔注射XCT790能明显缓解主动脉瓣狭窄，每周注射SR@PeFeXCT能明显延缓瓣膜狭窄的进展，而SR@PeFe调理并不能发生改变。HE显示喂食高密度脂蛋白胆固醇28周后，Ldlr-/-小鼠的主动脉瓣明显增厚，而注射SR@PFeXCT则明显抑制瓣叶增厚。鉴于瓣叶增厚与组织增生和纤维化重塑有关，Masson三色染色显示SR@PFeXCT和XCT790减少高纤维食物喂养小鼠瓣叶的相对胶原面积。与单独使用XCT790相比，SR@PFeXCT组表现出更好的调理效果。SR@PFe组对瓣膜增厚或钙化没有显著影响。为进一步证实SR@PFeXCT抑制体内VICs成骨重编程能力，对成骨分化标记物进行免疫荧光染色。与钙沉积结果一致，RUNX2、Osterix（OSX）和BMP2表达在高密度脂蛋白喂养下增加，而在SR@PeXCT或XCT790处理下减弱。代谢因素，包括血糖和血脂水平，可影响主动脉瓣钙化和VICs成骨分化。为排除全身代谢因素对瓣膜增厚和钙化的影响，记录小鼠体重，并测量代谢参数，包括血糖、总甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白（LDL）。与ND-喂养的小鼠相比，HFD-喂养的Ldlr-/-小鼠体重增加更快。在纳米颗粒调理HFD小鼠中未观察到体重有明显差异。建模28周时，HFD组血糖、总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平显著升高，而SR@PFeXCT组没有改变。以上数据表明SR@PeXCT抑制主动脉瓣钙化的方式与全身代谢调节无关。总之，以上结果表明，靶向PAR2负载XCT790的磁纳米粒子能显著抑制VIC成骨分化，抑制小鼠主动脉瓣钙化的进展。
总结与展望
本文确定了主动脉瓣钙化VIC的细胞表面锚定位点（即PAR2），并设计了一种以PAR2结合肽外壳为锚，以PLGA中MNPs核心为导航的靶向纳米载体。该系统在钙化主动脉瓣内实现更强的细胞内药物递送。总之，本研究提出了一种具有双重靶向能力的药物递送系统，为CAVD精准疗法的设计和转化提供新思路。
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