1885年9月18日，东鲁米利亚首府普罗夫迪夫发生了一场反抗土耳其统治的起义。起义者成功推翻了土耳其总督，并宣布东鲁米利亚与保加利亚公国合并。随后，具有亲奥倾向的亚历山大·巴滕堡宣布成为统一的保加利亚大公。

此次保加利亚国家的统一引发了重大的外交冲突，导致了一场持续两年多的国际危机。

俄国长期以来对保加利亚持不满态度。亚历山大大公，作为德国贵族后裔及俄国皇后之侄，于1879年4月在沙皇的支持下登基为保加利亚大公。他执政后却逐渐对俄国的控制表示不满，并试图摆脱其影响。因此，俄国对保加利亚的统一持反对态度，沙皇指责亚历山大大公违反了《柏林条约》，并威胁撤回所有驻保加利亚的军官。1888年10月，欧洲列强在君士坦丁堡召开大使级会议，专门讨论保加利亚局势。为维持德俄关系，俾斯麦支持了俄国的要求。奥匈帝国则希望打破俄国在保加利亚的独占地位，以在该地区进行经济和政治渗透。为此，奥匈帝国早在1880年就与塞尔维亚商定了贝尔格莱德至保加利亚边境铁路的建设计划，并于1883年与保加利亚和土耳其达成协议，将铁路延伸至保加利亚境内。奥匈帝国却担忧起义会蔓延至马其顿，影响其势力范围，同时俾斯麦也阻止其采取反俄行动，以防止三皇同盟破裂。因此，奥匈帝国在会议上采取了与俄德一致的外交立场。

英国则支持保加利亚，反对俄国将东鲁米利亚与保加利亚分隔的提议。七年前，英国曾强烈反对大保加利亚计划，而现在则试图利用此次机会加剧保加利亚与俄国之间的矛盾，阻止俄国势力向地中海扩张。为此，英国提出了“个人名义下联合”的方案。会议进程在11月中旬遭遇障碍。11月14日，塞尔维亚为维护巴尔干地区力量平衡，对保加利亚宣战，但保加利亚军队取得决定性胜利。随后，11月28日，奥匈帝国要求保加利亚无条件从塞尔维亚撤军，保加利亚被迫接受，议和旨在恢复战前状态。塞保冲突为亚历山大大公与土耳其的协商带来转机。1886年2月，双方达成共识，土耳其根据英国建议，任命亚历山大大公为东鲁米利亚总督。4月6日，君士坦丁堡大使会议正式批准该协议，保加利亚的统一在妥协中得到承认。俄国却对此不满。8月21日，亲俄军官在俄国支持下绑架亚历山大大公，迫其退位并驱逐出境。保加利亚亲奥势力平息政变后，尝试请回亚历山大大公，但遭沙皇阻挠。9月7日，亚历山大大公宣布永久放弃保加利亚大公之位。9月25日，俄国派遣尼古拉·考尔巴斯将军至保加利亚，要求摄政当局任命亲俄人士为大公，引发保加利亚强烈反对。11月下旬，考尔巴斯及俄国驻保加利亚官员撤回国内。俄国随即宣布与保加利亚断交，并威胁采取军事手段。此后，保加利亚王位争夺持续至危机解除，俄国在保加利亚的政治影响力自柏林会议以来显著削弱。俄国的干涉导致俄奥关系紧张。1886年9月，匈牙利首相卡尔曼在布达佩斯议会发表演讲，明确表示任何政府都无权擅自对巴尔干半岛进行军事干涉或建立保护国。11月13日，奥匈帝国外交大臣卡尔·诺基发表声明，指出保加利亚问题应由欧洲各国共同解决，而非俄罗斯单方面处理。若俄罗斯采取军事行动，奥匈将对其采取敌对措施。同日，英国亦发表声明，明确反对俄罗斯对保加利亚的军事介入。德国首相俾斯麦再次面临在东部君主国间作出选择的艰难局面。他一方面对保加利亚的亲奥势力表示轻蔑，称其为“多瑙河下游的搅局者”，并指示德国驻土耳其大使将保加利亚问题暂时搁置，强调“只要存在合作的可能性，就必须维护三皇同盟的团结”。

同时，他建议俄罗斯派遣军队占领保加利亚，以换取俄罗斯对其反法政策的支持。然而，另一方面，俾斯麦又支持奥匈的强硬立场，积极推动英奥合作，并试图将英国卷入与俄罗斯的冲突，这一举动实际上削弱了《三皇协定》的基础。俾斯麦的意图在于通过挑起英俄战争，使俄罗斯陷入近东危机，从而为其对法国采取行动赢得自主权。保加利亚危机进一步暴露了奥匈帝国与俄罗斯在巴尔干地区利益扩张上的根本冲突。1887年，《三皇同盟条约》到期未续，标志着该同盟已失去其原有的制衡作用，其终结成为大势所趋。