一、细胞株鉴定的重要性不可忽视
细胞株在生物医学研究中有着极为广泛的应用。它们为科学家提供了一个可控、可重复的实验系统，有助于揭示生命的基本规律和疾病的发生机制。例如，在药物开发过程中，细胞株被广泛用于药物作用机制研究和毒性评价；在疾病模型构建方面，细胞株可以作为疾病模型，用于研究疾病机理和筛选潜在治疗方法。
然而，由于细胞系的广泛应用，细胞株误认与交叉污染的问题日益突出。据中国科学院细胞资源数据库显示，中国有 20% 以上的细胞被误认，甚至中国典型培养物保藏中心发表的数据表明有超过半数的中国科研细胞株被误认。这一状况不容乐观，细胞株的错误识别和交叉污染可能导致实验结果不准确、实验失败等严重后果。
首先，错误的细胞株可能会浪费大量的时间、人力、物力等实验资源。科研人员在使用错误的细胞株进行实验时，往往需要花费大量的时间和精力去重复实验，以验证结果的可靠性。其次，实验结果不准确会影响科研成果的准确性和可靠性。如果使用了被污染的细胞株，可能会得出错误的结论，误导后续的研究方向。再者，细胞株的错误识别和交叉污染还可能影响科研进度，阻碍科研成果的产出速度和质量。最后，在医学研究中，使用错误的细胞株进行实验可能会对实验对象造成伤害，违反伦理道德。
因此，细胞株鉴定对于保证实验结果的可重复性、准确性和可靠性至关重要。它不仅可以避免实验资源的浪费，还可以提高科研成果的质量，推动生物医学研究的发展。
二、细胞株鉴定的方法多样且有效
（一）形态学鉴定
光学显微镜检查：
培养瓶（皿）或培养板直接置于倒置显微镜下观察，上皮细胞呈多边形，边界清晰，大小规则，核呈圆形，核质比例小，细胞间排列整齐，为单层培养物，无重叠生长，是正常上皮组织来源；成纤维细胞呈长梭形，核小而圆，细胞排列规则、整齐，为单层培养物，无重叠生长，是正常间质组织来源。肿瘤组织来源的贴壁细胞，其单层培养物呈多层重叠生长。
细胞染色检查：将无菌小玻片于细胞传代接种前放入培养瓶皿内，接种细胞悬液后培养，经 PBS / 甲醇固定液固定，吉姆萨染色液染色，清水漂洗干净，置于空气中干燥，用二甲苯透明，用光学树脂胶片封片后观察。上皮细胞和成纤维细胞的形态与直接镜检相同，细胞核染成紫红或蓝紫色，胞质染成粉红色。
电子显微镜观察：
通常用透射电镜检查细胞的超微结构。取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化，加培养液悬浮消化的细胞，离心收集细胞，经戊二醛固定，包埋，超薄切片；也可采用细胞原位包埋的方法，将细胞培养于电镜用特殊膜上，进行固定，包埋。
在电镜下可见到上皮细胞的张力原纤维和桥粒等，腺细胞可见胞质中的分泌颗粒，这对确定培养细胞系组织来源有重要意义。
（二）细胞核型分析
制备中期细胞分裂象样本：
取对数生长期的细胞悬液，加入秋水仙素处理，然后用胰蛋白酶消化细胞或手振摇培养瓶使细胞脱落，收集中期分裂象细胞，加入冰醋酸一甲醇固定，多次离心收集分裂象细胞。
制备染色体玻片：
将沉集的细胞加入醋酸甲醇分散细胞，取一滴细胞悬液加到冰冷的玻片上，同时用口吹散细胞液滴，使细胞均匀分散于玻片上。可多制备几张染色体玻片，待干燥后染色、镜检。
染色体计数及核型分析：
取染色体玻片经吉萨姆染色后镜检。在显微镜下可观察到多个中期分裂象细胞染色体，计数 50～100 个细胞染色体数目，并计数出细胞染色体的分布。人正常细胞有 46 条染色体，为 23 对二倍体。染色体分组排列，每组染色体无增加或减少，无异常染色体。小鼠染色体为 40 条，以顶端着丝点为主。人的染色体则为中央着丝点，数目与着丝点位置可作为细胞系是人或鼠来源的依据。
（三）细胞 DNA 指纹技术检测
制备细胞 DNA 的杂交膜：
用胰蛋白酶消化培养细胞，离心收集细胞，提取细胞 DNA，经 EcoRI 酶切，上样到分析胶上，与其他已知细胞系的酶切 DNA 为对照，以及与分子量标准标志物一起电泳，分析胶变性后进行 Southern 印迹杂交分析，将分析胶中的 DNA 电转移至硝酸纤维膜上。
制备标记 M13 噬菌体探针：
放射性同位素标记 M13：DNA，取稀释的 M13 噬菌体与无菌蒸馏水混合，沸水浴后冰上冷却，加入缓冲液、牛血清白蛋白、a-[32P]-dGTP、Klenow 酶，混合后短暂离心，放置温室。然后纯化 M13 DNA 探针，加到已平衡好的葡聚糖柱内，收集洗出液作为探针，沸水浴后移至冰上冷却，待杂交用。
DNA 杂交：
用标记好的 M13 探针与细胞 DNA 进行 Southern 印迹杂交分析。首先将转移膜放入预热的预杂交液袋中，置 55℃振摇 4h，然后移到预热的杂交液袋中，于 55℃，同时加入探针进行杂交。次日将杂交后的转移膜置洗液中室温漂洗，再用预热含有 SDS 的洗液冲洗，最后用 1×SSC 液洗膜，置滤纸上自然晾干。用放射性检测仪检查膜上存在的放射性同位素，进行放射自显影，冲洗 x 线胶片。自显影胶片上显示细胞 DNA 的电泳带型和组织来源细胞 DNA 对照的带型等，可判断细胞系来源。
（四）其他鉴定方法
同工酶检测试剂盒操作规程：
选择乳酸脱氢酶 LD，苹果酸脱氢酶 MD，葡萄糖－6－磷酸脱氢酶 G6PD，核苷酸磷酸脱氢酶 NP 为分析对象。通过细胞培养、细胞裂解、酶活性测定等步骤，应用电泳技术将同工酶分开，呈显不同位置之同工酶图谱，以此作为已建立的细胞株、细胞系的遗传标记来鉴别其种源和正确性。
细胞系和细胞株的鉴定指标及方法：目前细胞系和细胞株的鉴定指标主要有形态学特征、细胞核型分析、DNA 指纹技术检测、同工酶检测等。这些方法从不同角度对细胞株进行鉴定，确保细胞株的正确性和可靠性。
三、细胞株鉴定的标准明确清晰
（一）纯度标准
细胞系的纯度包括鉴定除主类细胞外还含有哪类细胞及其所占比例多少。例如，在进行细胞株鉴定时，需要检定细胞中是否存在其他类型的细胞污染，确保细胞株的纯度达到实验要求。一般来说，可以通过特定的染色方法或流式细胞术等技术来检测细胞的纯度。
（二）细胞学特征标准
观察细胞系的形态和表达特征的数据及其与来源细胞的差异。不同来源的细胞具有不同的形态和表达特征，通过对这些特征的观察和分析，可以判断细胞株的正确性。例如，上皮细胞呈多边形，边界清晰，大小规则，核呈圆形，核质比例小，细胞间排列整齐；成纤维细胞呈长梭形，核小而圆，细胞排列规则、整齐。在电子显微镜下，上皮细胞可见张力原纤维和桥粒等，腺细胞可见胞质中的分泌颗粒。
（三）稳定性标准
细胞连续培养过程中主要指标有无明显变异。使用稳定的细胞系能保证实验结果的准确性、重复性。稳定性主要应考虑两个方面，即生产产品的一致性和贮存在规定条件下的细胞能否维持其生产能力。评估培养期间的稳定性，至少应考察两个时间点，一个是采用最少传代数的细胞，另一个是申请上市的生产中达到或超过细胞体外传代限度的细胞。
（四）污染情况标准
微生物污染检查有无病毒、细菌、真菌、支原体等污染。细胞培养过程中，容易受到各种微生物的污染，这些污染会影响细胞的生长和实验结果的准确性。因此，在进行细胞株鉴定时，需要对细胞进行微生物污染检查，确保细胞无任何污染。
常用的鉴定方法包括：
鉴别试验：应采用合适的试验证明建库的细胞就是它本身。鉴别试验可利用细胞的表型或遗传型特征，通常对主细胞库（MCB）作鉴别试验。对于人或动物细胞，可采用形态学分析与其他试验相结合的方法，如同工酶分析、染色体条带分析、种属特异性抗血清的方法、DNA 分析等。
纯度检测：评估 MCB 和工作细胞库（WCB）的生物学纯度，即游离的外源微生物和外源细胞污染。主要检测细菌、真菌、支原体的存在，以及根据细胞系的培养史，通过筛选和相关的特异性试验，选用可检测广谱病毒的方法。
细胞基质的稳定性：考察细胞在生产中的适用性，主要考虑生产产品的一致性和贮存在规定条件下的细胞能否维持其生产能力。
细胞核学和致瘤性试验：根据细胞类型、产品的性质以及生产工艺，决定是否有必要采用胞核学和致瘤性试验来评价二倍体细胞系的安全性或鉴定一个新的细胞系。
四、细胞株鉴定的时机与处理措施
（一）细胞株鉴定的时机
发表文章时：许多科研期刊要求作者在投稿时提供细胞株鉴定报告，以确保研究结果的可靠性。例如，国际癌症杂志（IJC）是最早将提供细胞株鉴定报告列为强制性投稿要求的 SCI 期刊之一，其规定细胞株鉴定报告的有效期为 3 年。
进行临床治疗时：在细胞治疗等临床应用中，细胞株的正确性和安全性至关重要。因此，在进行临床治疗前，必须对细胞株进行严格的鉴定，确保其无错误识别和污染。
应用细胞株作为生物药研究的实验材料时：生物药的研发需要高质量的细胞株，因此在使用细胞株进行生物药研究时，也需要进行细胞株鉴定，以确保实验结果的准确性和可靠性。
准备冻存保种或已冻存多年的细胞时：冻存的细胞在使用前需要进行鉴定，以确保其细胞特性没有发生改变，并且没有受到污染。
当实验室获得新细胞或细胞传代 5 代以上时：新获得的细胞可能存在错误识别或污染的风险，而细胞在传代过程中也可能发生变异或污染。因此，在这些情况下，需要对细胞株进行鉴定。
细胞表现不稳定或结果与预期差别较大时：如果细胞的生长特性、形态或实验结果与预期不符，可能是细胞株出现了问题，此时需要进行细胞株鉴定，以确定问题的原因。
（二）发现细胞错误识别或污染时的处理方法
立即丢弃：如果实验室中发现有细胞株是错误识别的或已经被污染，应当立即将其丢弃，以防止污染扩散。例如，SGC - 7901 胃癌细胞株被证实被 Hela 污染后，应立即丢弃被污染的细胞株。
质疑研究结果：使用错误识别或污染的细胞株进行实验而获得的研究结果应受到质疑。科研人员需要重新评估实验结果的可靠性，并考虑是否需要重新进行实验。
告知其他研究人员：将细胞株错误识别或污染的情况告知其他研究人员，因为他们可能在自己的实验中也使用了相同的细胞株。这样可以避免其他研究人员继续使用错误的细胞株，减少不必要的损失。
进行污染源调查：对细胞株错误识别或污染的原因进行调查，以防止类似情况再次发生。可能的原因包括实验操作不当、细胞系来源不明、细胞系标记错误、细胞系培养条件不当等。
采取补救措施：如果细胞株非常宝贵，可以尝试采取一些补救措施。例如，对于细菌污染，可以先用带有双抗的 PBS 反复冲洗几遍，然后在培养液中加入硫酸庆大霉素、新霉素（50ug/ml）等，培养 3 天后换成带有双抗的培养液培养；对于真菌污染，可以采用两性霉素 B（0.25 - 2.5），三天后换液加入含 PS 的培养液；对于支原体污染，可以使用支原体检测试剂盒进行检测，如果确定是支原体污染可以选择支原体去除试剂进行处理。但需要注意的是，这些补救措施并不一定能完全清除污染，且可能对细胞产生一定的影响。
五、细胞株鉴定的仪器
光学显微镜：是细胞株形态学鉴定的常用仪器。其价格相对较为亲民，一般在几千元到几万元不等。例如，常见的倒置光学显微镜，能够清晰地观察细胞的形态、大小、排列等特征，为细胞株的初步鉴定提供重要依据。
电子显微镜：在细胞株鉴定中，电子显微镜能够提供更高分辨率的图像，观察细胞的超微结构。透射电子显微镜价格较高，通常在几十万元到上百万元不等。它可以观察到上皮细胞的张力原纤维和桥粒等结构，以及腺细胞胞质中的分泌颗粒，对于确定培养细胞系的组织来源具有重要意义。
毛细管电泳仪：如 DS3000 Compact CE Sequencer，在细胞株鉴定中广泛用于对 STR 进行分析。该仪器价格较高，具体价格因配置和功能而异。通过 PCR 扩增多个 STR 后，利用毛细管电泳鉴定每个等位基因，然后与参考等位基因进行比较，从而鉴定细胞株。当以 DS3000 获取的等位基因与参考等位基因的一致程度大于等于 80% 时，可判断为相同细胞。
高通量智能细胞分析仪：例如 Countstar Castor X1 高通量智能细胞分析仪，集双通道荧光成像和智能数据分析于一体。它可以进行单克隆源性鉴定、细胞转染效率分析、高通量台盼蓝计数等多项功能。其价格根据不同配置有所差异，一般在几十万元左右。
