在细胞生物学研究中，Calcein AM/PI 双染是一种常用的检测细胞活性与凋亡的方法。合理设置对照组对于准确解读实验结果至关重要。

一、对照组设置

活细胞对照组：仅用 Calcein AM 对正常培养且已知活力良好的细胞进行染色。该组细胞应呈现出强烈的绿色荧光，表明 Calcein AM 成功进入活细胞并被酯酶水解产生荧光，可用于确定仪器检测活细胞荧光的最佳参数范围以及评估实验操作过程中对活细胞的影响。

死细胞对照组：先对细胞进行处理使其死亡（如高温处理、强化学试剂处理等），然后仅用 PI 染色。这组细胞应只显示出红色荧光，因为死细胞的细胞膜完整性丧失，PI 能够进入细胞核结合 DNA 而发出荧光。此对照组可用于校准 PI 染色及流式细胞仪检测死细胞荧光的条件，同时也能验证细胞死亡处理的有效性。

未染色对照组：不添加任何染料的细胞样本。用于检测细胞自发荧光以及排除仪器背景噪音对结果的干扰，为后续准确分析染色细胞的荧光信号提供基础数据。

二、流式结果分析

荧光信号采集：通过流式细胞仪分别采集 Calcein AM（绿色荧光，通常为 FL1 通道）和 PI（红色荧光，通常为 FL3 通道）的荧光信号强度。

活细胞群体分析：活细胞由于细胞膜完整，Calcein AM 进入细胞后发出绿色荧光，在流式散点图中，活细胞会聚集在 FL1 通道信号较强而 FL3 通道信号较弱的区域。通过分析该区域细胞数量占总细胞数量的比例可得到活细胞的比例。

死细胞群体分析：死细胞因细胞膜通透性增加，PI 进入细胞核染色，在散点图中表现为 FL3 通道信号较强的区域。死细胞比例即为该区域细胞数量与总细胞数量之比。

凋亡细胞分析：在某些情况下，凋亡早期细胞可能会有细胞膜通透性的轻微改变，Calcein AM 荧光强度可能略有下降，同时 PI 染色也较弱，这类细胞可能位于活细胞与死细胞群体之间的过渡区域。可通过进一步设置合适的荧光强度阈值和区域划分来识别并定量凋亡细胞群体。

综上所述，在 Calcein AM/PI 双染细胞实验中，精心设置对照组并准确分析流式结果，能够为细胞活性、凋亡等相关研究提供可靠的数据支持，有助于深入探究细胞生理状态及药物、环境因素等对细胞的影响机制。