20世纪70年代，科学家们就提出了基因治疗的概念。狭义的基因治疗是指将一个正确的基因片段直接导入患者的体内，实现在体的基因增加、修改来治疗疾病。但苦于无法将基因片段或者基因编辑工具在体内有效传递，早年的基因治疗发展一直较缓慢。
直到科学家们意识到病毒似乎可以肩负起这项使命，因为它们能够将自身的遗传物质引入到宿主细胞内，并利用宿主的“细胞工厂”持续表达，是非常天然的载体。于是，基因治疗迎来了从概念走向现实的关键性突破。
近十年间，基因治疗蓬勃发展，FDA已经先后批准了3款基因治疗产品，它们均以腺相关病毒（AAV）为载体，标志着我们对疾病的治疗开始迈入基因时代。
本文盘点了使用AAV载体向体内递送基因片段，在眼科疾病、血液疾病、神经退行性疾病等多类遗传疾病的临床应用，以及部分研究进展靠前的国内公司。
一
AAV作为基因递送载体的优势
腺相关病毒（adeno-associatedvirus，AAV）是一种大小约为26nm，只包含一条单链线状DNA基因和蛋白质衣壳的无包膜病毒，最早在恒河猴肾细胞的培养物中首次发现。
AAV只包含一条单链线状DNA基因，所以无自主复制能力，需要与辅助病毒（腺病毒或疱疹病毒）进行共感染以便复制。AAV基因组由rep和cap基因组成，分别负责病毒的生命周期和基因组周围衣壳的形成。科学家将病毒自身的基因组除去，装入治病所需的人类正确基因片段。AAV所载的目的基因可以以闭环DNA的形式存在宿主细胞内，整合突变风险低。野生型AAV依赖rep基因进行低频定点整合，重组型rAAV不整合。所以，AAV是安全级别最高RG1级的基因治疗载体，而腺病毒安全级别是RG2，逆转录病毒是RG3。
图 1 AAV载体基因治疗的过程（来源：Sangamo公司官网）
AAV的衣壳蛋白以二十面体的构型聚集在一起，在结构上形成刺状突起，这些突起介导与靶向细胞表面蛋白质的相互作用，赋予了不同类型的AAV特异性地靶向不同细胞的能力。目前实验中已有多种AAV血清型，可以靶向不同的细胞组织。
图 2 不同AAV血清型的组织亲和性（来源：Genecreat公司官网）
相比于慢病毒载体递送技术，AAV的基因组整合风险小很多（rAAV无整合风险）；相比于纳米复合材料递送技术，AAV递送的靶向性更好，转染率也更高。此外，AAV在体内表达外源基因时间也较长，所以近年来，AAV已经快速发展成一种非常有前途和有吸引力的递送方法，各基因治疗公司也开展了很多AAV相关的基因治疗临床试验。
二
AAV在基因治疗领域的应用
表1：眼部疾病的临床应用（来源：各公司官网，丰硕创投整理）
2017年，FDA批准了罗氏旗下Spark公司的Luxutrna用于治疗RPE65基因突变导致的先天性黑蒙症，标志着基因治疗在眼遗传性疾病上获得了发展成熟。
这一方面得益于眼睛是免疫特权器官，血-眼屏障使得眼睛与免疫系统相对独立。使用病毒类载体不易发生免疫应答或全身性不良事件。另一方面是因为很多遗传性眼部疾病的基因突变已经被精准识别，为基因疗法开发提供了众多的靶点选择。
在国内，专注于眼科基因治疗的纽福斯公司，其用于治疗莱伯遗传性视神经病变的产品NR082（以AAV2为载体），近期已经获得NMPA许可正在开展临床试验（CTR20211179）。公司也于2021年2月顺利完成了4亿元B轮融资。
表2：血液疾病的临床应用（来源：各公司官网，丰硕创投整理）
Sangamo、Spark、uniQure公司关于血友病的临床进展均比较顺利，已经进入3期。不过2020年Nature Biotechnology的一篇研究论文《A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells》发现对9只A型血友病的狗进行AAV基因治疗试验后，在6只的肝脏组织中发现了1741个独立的AAV整合事件，其中44%的整合位点在参与细胞生长的基因附近，有诱发癌症的可能性。提示需要对AAV基因治疗的潜在遗传毒性进行长期监测
在国内，2021年5月17日，NMPA受理了信致医药科技申报的AAV基因治疗B型血友病BBM-H901的临床试验申请。这是继纽福斯之后，国内申报临床的又一款AAV基因治疗。
此外，本导基因关于治疗地中海贫血的BD211项目，采用自主专利的慢病毒载体递送技术，可提高了病毒产量以及感染效率的同时降低基因整合突变的风险。公司于2021年4月，完成A轮6000万元融资。
另外，至善唯新创始人也表示公司拥有自主专利的VV-Ad/AAV生产技术，目前已研制出A型和B型血友病的基因治疗药物。今年2月，公司完成数亿元A轮融资，君实生物收购公司1.5957%股权。
表3：神经退行性疾病的临床应用（来源：各公司官网，丰硕创投整理）
AAV载体设计和相关给药技术的进展使得AAV能够在大脑和脊髓中广泛地传递基因，这使得AAV特别适合于神经系统疾病的治疗。由于中枢神经系统（CNS）中的靶细胞是长寿命的、不分裂的神经元，因此单次剂量的治疗可以产生持久的、甚至终生的益处。
Axovant公司使用慢病毒载体同时编码多巴胺合成的三个关键酶：TH、CH1和AADC，重要的是需要优化3个转入的基因的表达。因为之前有研究发现，使用AAV载体治疗帕金森的早期结果，但是到了安慰剂对照的2期，就几乎没有显著结果。
而国内公司在此方向的基因治疗研究项目还比较少。
表4：其它遗传类疾病的临床应用（来源：各公司官网，丰硕创投整理）
作为首个获批上市的基因治疗药物Glybera，它使用AAV载体将产生功能性脂蛋白脂肪酶的基因递送到患者骨骼肌，降低患者胰腺炎的发病率，但是不能彻底治愈。Glybera针对的适应症过于罕见（发病率约为百万分之一）而且误诊率较高，上市后只有一位患者接受了该药治疗，只得于2017年黯然退市。
另一家公司Solid Biosciences，针对杜氏肌营养不良症开发的产品SGT-001，最初是使用高浓度的AAV9载体，由于首名接受治疗的患者出现了严重的副作用，FDA曾一度决定暂停该临床试验，在公司积极回答所有问题后，被许可重新启动试验。2020年，在基因和细胞治疗(ASGCT)年会上Solid披露了最新的试验数据，表明新设计的AAV-SLB101在小鼠和Duchenne人类骨骼肌细胞体外实验中显示出优于AAV9的基因转导效率；体内试验也显示AAV-SLB101在四头肌和心肌的生物分布明显高于AAV9，同时肝脏的生物分布低于AAV9。
而在国内，专注于罕见病领域的锦篮基因也已经完成脊髓性肌萎缩症基因治疗药物的临床前研究，计划于今年下半年提交IND申请进入临床试验。公司于今年2月完成近亿元天使轮融资。
此外，博雅辑因也正在开发用于治疗黏多糖贮积症I型最严重亚型Hurler综合征的体内RNA单碱基编辑技术。公司于今年4月顺利完成4亿元B+轮融资。
三
AAV基因治疗临床试验带给我们的启示
从上述的临床试验中，我们看到，即使是被认为最安全的AAV载体，也有可能带来严重的治疗后果。
这很大原因来自于病毒引发的炎症因子风暴，极易造成肝功能急性损伤；另外，一个人若长期暴露于某种病毒载体，免疫系统将产生对该感染的记忆，使人产生抵抗力，将对再次的基因递送和持久基因表达构成障碍。
所以，研究人员正在采用一系列方法来改造AAV。通过改造病毒载体的基因结构、扩大其载体容量、提高病毒产率以及对不同组织细胞的转染效率，以使AAV载体更加符合不同疾病的需求。
另外在生产工艺上，对载体生产的纯度也有很高要求。空病毒衣壳不含有治疗基因但会引起免疫反应，而且空衣壳会和完整衣壳竞争感染患者细胞，若要达到治疗效果就需要加大剂量，会带来高剂量副作用。
最后一个绕不开的问题就是昂贵的生产成本了。就美国现阶段的生产工艺来看，AAV病毒大规模生产的成本平均每人约为50-100万美元。这远远超出了人们普遍的经济承受能力，加上目前国内的保险制度还不完善，相当于对国内的基因治疗公司提出了更高的要求。
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