多细胞生物从单细胞祖先进化而来，每种细胞类型都获得了专门的功能，这需要越来越复杂的基因调控机制。除了由作用于调控序列的 DNA 结合因子介导的转录基因调控外，随着生物体进化而来的复杂性不断增加，其他形式的控制系统也应运而生。数亿年来，编码微小非编码 RNA 分子（即所谓的 microRNA）的基因在多细胞生物的基因组内扩增，对 mRNA 稳定性和蛋白质翻译发挥转录后控制作用。直到 1993 年 Victor Ambros 和 Gary Ruvkun 发现 microRNA 及其基因调控模式之前，人们对此一无所知。这两位诺贝尔奖获得者研究了突变的秀丽隐杆线虫，这些线虫因 lin-4 和 lin-14 基因位点的改变而导致发育缺陷。Ambros 的实验室克隆了 lin-4 基因，并意外发现它不编码蛋白质。相反，它编码了一个 22 个核苷酸的短非编码 RNA。与此同时，Ruvkun 实验室确定 lin-4 通过其 3' 非翻译区 (3'UTR) 中的多个元素调节 lin-14。通过比较序列信息，他们确定了短非编码 lin-4 RNA 和 lin-14 的 3'UTR 元素之间的部分序列互补性。这让我们首次看到了一种概念上新颖的调节 RNA：microRNA。2000 年，Ruvkun 实验室发现了高度保守的 let-7 microRNA，随后在包括人类在内的各种动物物种中鉴定了同源 microRNA。这引发了对整个动物界的 microRNA 进行克隆和测序的激烈努力，最终发现 microRNA 包含一大群控制大量蛋白质编码基因网络的调节因子。Ambros 和 Ruvkun 的发现完全出乎意料，揭示了一种由微小 RNA 介导的进化保守的转录后调控机制，在动物发育和成人组织功能中发挥着关键作用。

控制每个基因何时何地转录为 RNA 并翻译成蛋白质是生命的一个基本方面（图 1）。例如，胰岛素在胰岛的 β 细胞中产生，而视蛋白则在眼睛的视网膜中产生。针对特定细胞类型的精确基因调控指令编码在遗传物质本身中，并由序列特异性的 DNA 结合蛋白起作用。François Jacob和Jacque Monod因发现基因调控方式而于 1965 年获得诺贝尔生理学或医学奖。DNA 结合转录因子库在单细胞和多细胞真核生物中得到了很好的保存（King et al.，2008），而在多细胞生物中出现了额外的基因调控层，以确保在每种细胞类型中随时正确产生 RNA 和蛋白质。

真核生物模型生物对遗传学研究具有无价的价值，带来了许多意想不到的发现。悉尼·布伦纳在五十多年前引入了线虫 秀丽隐杆 线虫（C. elegans）。这种生物的繁殖周期短、透明度高，并且易于进行基因操作，因此促进了广泛的研究。悉尼·布伦纳、约翰·苏尔斯顿和罗伯特·霍维茨利用 秀丽隐杆线虫 揭示了在器官发育过程中细胞分裂、分化和细胞死亡是如何受到基因控制的，他们因这一发现获得了 2002 年诺贝尔生理学或医学奖。

20 世纪 70 年代， Brenner 实验室对 秀丽隐杆线虫进行的诱变筛选发现了lin-4 突变体 (e912)。这些线虫表现出惊人的表型：许多细胞类型和形态结构完全缺失，由于外阴发育失败而积聚卵子（图 2）（Horvitz 和 Sulston，1980 年；Chalfie、Horvitz 和 Sulston，1981 年），似乎是特定细胞谱系发育程序的重复。

在lin-4突变体中观察到的线虫发育严重中断表明lin-4编码了发育时间的主要调节器。大量表现出各种时间发育缺陷的额外异时性突变体被鉴定出来，包括 Horvitz 实验室发现的第二个突变体lin-14（Ferguson、Sternberg 和 Horvitz，1987 年）。

图 2. 具有发育缺陷的异时性线虫突变体。线虫lin-4和lin-14突变体动物发育受到干扰。突变的lin-4线虫重申了细胞谱系的发育程序，以积累内部卵子而不形成阴户，而lin-14突变体较小且缺乏幼虫发育。

与此同时，Victor Ambros 在David Baltimore的指导下攻读了脊髓灰质炎病毒基因组结构和复制方面的博士学位，随后加入了 Horvitz 实验室。在攻读博士后期间，Ambros 立即着手对异时性突变体进行基因分析，并发现lin-14具有与lin-4突变体中观察到的相反的发育时间缺陷（图 2）。在lin-14突变体中，幼虫程序完全缺失（Ambros 和 Horvitz，1984 年）。值得注意的是，Ambros 后来发现lin-4是lin-14的负调节因子（Ambros，1989 年）。

在此期间，加里·鲁夫昆在弗雷德里克·奥苏贝尔的指导下完成了细菌遗传学博士学位。在欧洲旅行时，他在了解了异时性突变体的细胞谱系分析后对蠕虫遗传学产生了浓厚的兴趣（Chalfie、Horvitz 和 Sulston，1981 年；Ruvkun、Wightman 和 Ha，2004 年）。随后与马丁·查尔菲和罗伯特·霍维茨的讨论进一步激发了他对使用秀丽隐杆线虫研究这些问题的兴趣。1982 年，鲁夫昆开始在沃尔特·吉尔伯特和罗伯特·霍维茨的实验室联合进行博士后研究。

在 Horvitz 实验室，Ambros 和 Ruvkun 开始了克隆lin-14 的长期探索。当时，确定由遗传学定义的基因座的 DNA 序列是一项艰巨的任务。经过多年的坚持不懈的实验，他们使用经典的限制性片段长度多态性方法成功确定了该区域（Ruvkun等人，1989 年）。在此期间，Ambros 和 Ruvkun 都获得了教职，Ambros 在哈佛大学，Ruvkun 在麻省总医院和哈佛医学院。他们致力于解决自己的问题，继续进行分子分析。Ruvkun 证明 lin-14 是一种在发育过程中具有阶段特异性表达的核蛋白，在 L1 阶段表达较高，并在lin-4和lin-14突变体中发生改变（Ruvkun 和 Giusto，1989 年）。有趣的是，人们发现了lin-14获得功能突变体，其中 3'UTR 被删除（Ruvkun 和 Giusto，1989 年；Wightman等人，1991 年），导致 lin-14 蛋白检测时间延长至 L1 阶段之后（Arasu、Wightman 和 Ruvkun，1991 年；Wightman等人，1991 年）。3'UTR 元件的破坏对蛋白质序列没有影响，因此 Ruvkun 推测，作用于 mRNA 稳定性、核输出或翻译的转录后机制可能介导了lin-14中的时间转换（Wightman等人，1991 年）。

与已鉴定的几种lin-14突变体不同，在lin-4中仅发现了一种突变体 (e912)。Ambros 实验室着手克隆lin-4基因，以限制性片段长度多态性和南方印迹探测为指导。他们“沿着染色体行走”并反复测试较小的基因组片段，看它们能否挽救突变的lin-4表型，最后确定了一个 693 bp Sal ll限制性酶片段。经过多轮开放阅读框预测和克隆重新测序以排除错误后，他们开始怀疑lin-4基因可能是非编码 RNA，因为它的开放阅读框 (ORF) 序列较短。引入秀丽隐杆线虫序列的移码突变不会影响lin-4功能，证实了这一怀疑。1991年，该实验室开始通过Northern印迹和RNase保护试验探测lin-4转录本，发现了两个长度分别为61个和22个核苷酸（nt）的短RNA转录本（图3）。

图 3. 两种短 lin-4 转录本的鉴定。野生型、lin-4 (e912) 突变体和用 Sal I 片段拯救的lin-4 (e912) 突变体的总 RNA 的 Northern 印迹，用放射性标记的lin-4 RNA 探针进行探测，并与 U6 上样对照进行比较。

1992 年 6 月 11 日晚上，Ambros 和 Ruvkun 分别独立推导出 lin-4 （Ambros 实验室）和 lin-14 （Ruvkun 实验室）的序列，并交换了lin-4 和 lin-14 基因的序列数据。两人都注意到 lin-4非编码 RNA 与lin-14 3'UTR 中的多个元件 之间存在明显的部分互补性（图 4）。

意识到这一观察的重要性后，这两个实验室进行了一系列额外的实验，证明 lin-4 microRNA 通过与位于 3'UTR 中的元素进行碱基配对来调节 lin-14 mRNA。1993 年，他们连续在《细胞》杂志上发表两篇论文，报道了这一开创性的发现（Lee, Feinbaum 和 Ambros，1993 年；Wightman, Ha 和 Ruvkun，1993 年）。

图 4. lin-4和lin-14 RNA中的互补序列元素。通过比较lin-4和lin-14的克隆序列，我们发现短的 22 nt lin-4 RNA 与lin-14 3'UTR中的重复元素具有部分互补性。

Ambros 实验室利用 秀丽隐杆线虫 lin-4 序列 在其他线虫物种（C. briggsae、 C. remanei 和 C. vulgaris ）中识别出相应的含有lin-4的克隆。这些实验表明， 来自其他线虫的 lin-4克隆可以挽救秀丽隐杆线虫中的lin-4 突变表型 。他们还筛选了超过 20,000 条诱变染色体，以识别出第二个 lin-4 突变体 (ma161)，其中包含一个单核苷酸突变。值得注意的是，该突变存在于互补序列中，进一步支持了 lin-4 microRNA 和 lin-14 3'UTR 元件之间互补碱基的功能意义（Lee、Feinbaum 和 Ambros，1993 年）。

Ruvkun 实验室比较了野生型和 lin-14 获得功能突变体中 lin-14 蛋白质和 RNA 的量。突变体中的 Lin-14 蛋白质增加了 4 到 7 倍，而 RNA 量没有差异，表明 lin-14 在转录后水平（即 RNA 转录后）受到调控。将 lin-14 3'UTR 转移到报告基因中会导致报告基因的转录后调控类似于 lin-14，表明异源 3'UTR 足以控制 mRNA 翻译。反复将 lin-14 3'UTR 的较小片段转移到报告基因中，直到鉴定出具有功能的 124 nt 长的 3'UTR 片段。该 3'UTR 区域含有几个与lin-4部分互补的序列 ，并且该区域在 C. briggsae中是保守的 （Wightman、Ha 和 Ruvkun，1993）。

对新发现的 lin-4 microRNA 进行计算机分析，将其与来自所有物种的核苷酸序列综合数据库进行对比，发现只有其他秀丽隐杆线虫（例如 C. briggsae）才有匹配的序列。一个关键问题仍然存在：microRNA 的存在是线虫独有的特性，还是在整个动物界中都具有深远的功能影响？

在第一个 microRNA lin-4突破性地发现之后 ，七年后，第二个 microRNA 基因 let-7才被发现。Ruvkun 实验室进行了基因筛选，重点寻找能够抑制 lin-14 和 egl-35 基因座突变菌株的合成不育表型的突变体 (Reinhart 等人，2000)。 发现Let-7 编码一个短的 21 nt RNA，该 RNA 与各种异时基因的 3'UTR 互补，包括 lin-14、 lin-28、 lin-41、 lin-42 和 daf-12。let -7的缺失 导致成虫阶段幼虫细胞命运的重复。第二个 microRNA 基因的发现表明 microRNA 可能在调节发育过程中细胞谱系形成的阶段特异性时间方面发挥更广泛的作用。

下一个突破是，Ruvkun 实验室发现 let-7 基因与lin-4不同 ，它在多种动物中都是进化保守的。将 let-7 microRNA 序列与核苷酸数据库进行比较，发现在果蝇和人类中都有匹配的序列（Pasquinelli 等人，2000 年）。let -7 在线虫中 已确定的一个靶标 是 lin-41（Reinhart等人，2000 年），这是一种在斑马鱼和果蝇中都有直系同源物的蛋白质。令人欣