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骨折是一种普遍存在的肌肉骨骼系统损伤。尽管骨折诊治取得显著进展，但约5%−10%具有复杂损伤机制的患者可能会遇到延迟愈合或不愈合。近年来，骨组织工程已成为骨折和骨不愈合损伤的一种很有前途的方法。
因此，南京工业大学余子夷教授、南京医科大学梁斌教授、桂鉴超教授和Zhaowei Yin共同探讨了外泌体（Exos）的成骨和血管生成潜能是否可以通过外泌体miRNA（microRNA）的过表达来增强，并确认将Exos装载到HMPs（水凝胶微粒）中是否在新骨形成过程中发挥长期影响。成功获得骨髓间充质干细胞（ BMSCs）和Exos。体内外实验证实，HDAC4（组蛋白去乙酰化酶4）被miR-29a过表达所抑制，同时伴有RUNX2（Runt相关转录因子2）和VEGF（血管内皮生长因子）上调，从而增强成骨和血管生成能力。HMP@Exo体系由含HB-PEGDA（超支化聚乙二醇二丙烯酸酯）和SH-HA（巯基化透明质酸）的Exos通过微流控技术合成。RGD（Arg-Gly-Asp）肽修饰HMP表面以增强细胞粘附。该系统具有良好的注射性、显著的兼容性、优异的细胞粘附特性和缓慢的降解能力，而Agomir-29a-Exos增强BMSCs和HUVECs（人脐静脉内皮细胞）的增殖和迁移，同时促进成骨和血管生成。总之，本研究结果表明，HMP@Exo系统可以有效维持Exos的活性和半衰期，同时伴随着miR-29a（microRNA-29a）的过表达。该可注射系统通过耦合成骨和血管生成，为加速骨折愈合提供一种创新方法。
相关研究内容以“Multifunctional Injectable Hydrogel Microparticles Loaded with miR-29a Abundant BMSCs Derived Exosomes Enhanced Bone Regeneration by Regulating Osteogenesis and Angiogenesis”为题于2023年11月28日发表在《Small》。
示意图 HMPs和HMP@Exo的制备和作用示意图
本文介绍了一种超支化聚合物单体和硫化透明质酸的双重水凝胶前驱体体系。这两个组分通过迈克尔加成反应交联，从而使用微流控技术生产均匀的HMPs。为增强细胞粘附，将RGD肽移植到HMPs表面。为促进骨修复，HMPs被用来包裹miR-29a丰富的Exos，提供必要的生物活性。研究表明，HMPs复合载体系统（HMP@Agomir-29a-Exo）在促进新骨形成和血管生成方面具有显著的潜力。这些发现提供一种新治疗策略，以可注射制剂的形式用于骨折和骨缺损再生（示意图）。
图1 BMSCs和BMSC-Exos的特性分析
分离出BMSCs和相应的Exos并进行表征（图1A-E）。流式细胞术分析细胞表面抗原的表达，发现CD29/CD90高表达，CD45/CD11b低表达，与干细胞特征谱一致（图1F-I）。透射电镜（TEM）显示，Exos呈颗粒状分布，大小约为100nm（图1J、K）。分离的Exos富含外泌体标记物CD63、CD9和CD81，而Calnexin在分离的Exos中缺失或高度不足（图1L）。摄取实验证明BMSCs/HUVECs对Exos的内化及其随后在细胞质内发挥生物学功能的过程（图1M）。
图2 外泌体封装的HMP（HMPs@Exos）的制备及其流变学性质的综合表征
微流控乳液技术可以生成含有HB-PEGDA、SH-HA和Exos的预凝胶微滴（图2A、B）。通过调整两相的流速或微通道参数，可以将微滴大小精确地控制在70-100微米范围内（图2C）。当使用26G针时，所需的压力为20-22psi，说明颗粒状凝胶可以相对容易地从注射器中挤出，作为3D打印油墨，允许创建图案结构（图2D、E）。所得到的颗粒状水凝胶具有粘弹性凝胶行为（图2F）。此外，颗粒状水凝胶表现出经典的剪切变薄行为，在测试范围内，粘度随着剪切速率的增加而降低两个数量级（图2G）。在高应变下，G'迅速下降，但在过渡到低应变时迅速恢复，表明材料在通过小直径针时能够表现为粘弹性流体，随后恢复为弹性固体（图2H）。
图3 HMP@Exo中的Exos封装、分步和释放
在H2O2存在时，3.33% HB-PEGDA@1%SH-HA组在6天内降解，3.33% HB-PEGDA@1.33%SH-HA组在20天内降解，6.66% HB-PEGDA@1.33%SH-HA在50天内降解（图3B）。由于小鼠典型的骨愈合时间为21-42天，因此选择3.33% HB-PEGDA@1.33%SH-HA进行下一步实验，以确保HMPs在愈合期间发挥最大作用，在PBS方案中检测到Exos的最小释放（图3C）。HMPs表现出强烈绿色荧光（PEGDA），而红色点状荧光（Exos）在HMPs内密集而均匀分布（图3A）。为观察HMP@Agomir-29a-Exo与BMSCs共培养过程中细胞对Exos的摄取过程，建立了HMP@Agomir-29a-Exo与BMSCs共培养系统（图3D）。
图4 HMP@Agomir-29a-Exo对BMSCs/HUVECs的活力和增殖能力影响
Calcein AM/PI染色显示，BMSCs和HUVECs均表现出良好的活力，细胞死亡最少（图4A）。在5天的培养期间，这些细胞显示出增殖趋势（图4C、D）。EdU染色（图4B、E、F）和CCK-8（图4G、H）检测也证实细胞的良好增殖。
图5 HMPs的生物相容性
通过将HMPs与细胞直接共培养并进行Calcein AM/PI染色，观察到细胞呈现绿色荧光，随着培养时间延长，细胞数量逐渐增加（图5A、C）。细胞骨架染色清楚显示，BMSCs和HUVECs完全附着在HMPs上，并表现出扩散形态（图5B、D）。
图6 HMP@Agomir-29a-Exo对BMSCs成骨分化过程的影响
图7 BMSCs中成骨相关基因和蛋白的表达分析
共培养14天后，ALP染色显示，HMP@Agomir-29a-Exo组与HMP和HMP@Exo组相比，表现出最高的ALP活性（图6A、C）。共培养21天后，与HMP组相比，装载Exos的HMP组钙结节含量增加，HMP@Agomir-29a-Exo组增加最显著（图6B、D）。
PCR结果显示，HMP@Agomir-29a-Exo组培养7天和14天的BMSCs中RUNX2的表达显著上调（图7D、E），同时其他成骨基因（ALP、COL1、OCN）的表达增加。WB结果显示，HMP@Agomir-29a-Exo组中HDAC4表达显著下调，RUNX2表达相应上调（图7A-C）。免疫荧光染色显示，HMP@Agomir-29a-Exo组HDAC4的荧光强度显著降低，RUNX2、ALP、COL1和氰酸盐的荧光强度显著增加（图7F-J、K）。外泌体miR-29a的过表达抑制HDAC4表达，促进RUNX2表达。通过封装Exos，HMPs显著延长有效作用时间。HMP@Agomir-29a-Exo通过基因调控和持续的Exos释放，有效增强体外成骨分化。
图8 HMP、HMP@Exo、HMP@Agomir-29a-Exo组中HUVECs的血管生成分化能力
HMP@Agomir-29a-Exo释放的Agomir-29a-Exos显著影响HUVECs的试管形成过程（图8A）。定量分析结果显示，随着时间的推移，与试管形成相关的各种参数都有显著改善，包括网状面积、节点数、连接数和总长度（图8B）。免疫荧光染色显示，HMP@Agomir-29a-Exo组HDAC4表达显著降低，RUNX2和VEGF表达显著增加（图8C）。WB结果显示，在HMP@Agomir- 29a-Exo组中，HDAC4表达显著降低，RUNX2和VEGF表达显著增加（图8D-G）。这些结果表明，HMP@Agomir-29a-Exo中的外泌体miR-29a可能通过HDAC4/RUNX2/VEGF轴发挥血管生成作用。
图9 骨折修复的影像学评价
图10 建模后1、3、5周组织的组织病理学评估
图11 体内骨折部位成骨和血管生成相关蛋白的表达
Exo组、Agomir-29a-Exo组和HMP@Exo组在骨折部位可见明显的愈合组织形成，并随着时间推移逐渐增加，HMP@Agomir-29a-Exo组出现更明显的愈合组织形成（图9B）。CT重建图像显示Exo组和Agomir-29a-Exo组骨折后5周在骨折末端周围存在愈合组织，而HMP@Agomir-29a-Exo组的骨折线完全消失，愈合组织更完整，接近或达到周围正常皮质骨的密度（图9C）。BMD、BV/TV和Tb.Th在HMP@Agomir-29a-Exo组中显示出显著增加，而Tb.Sp显著降低（图9D-G）。H&E染色显示术后1周各组的愈合组织生长模式相似，差异很小（图10A）。随后通过Masson's染色阐明愈合组织中胶原纤维的形成（图10B）。术后5周，与其他各组相比，HMP@Agomir-29a-Exo组的HDAC4表达显著下调，RUNX2表达显著上调（图11A），成骨标志物ALP和OCN的表达也显著增加（图11B）。VEGF的免疫荧光染色显示，HMP@Agomir-29a-Exo组在愈合组织周围和内部的阳性表达显著增加，超过其他组水平（图11C）。所有体内实验结果表明，HMP@Agomir-29a-Exo通过增强成骨和血管生成表达，有效促进骨折部位的骨再生。
综上所述，本研究通过HB-PEGDA和SH-HA之间的迈克尔加成反应成功合成高度均匀的HMPs。在体内封装miR-29a丰富的Exos延长Exos在体内的有效持续时间。此外，HMPs表现出良好的生物相容性和可注射性，而RGD的表面修饰增强其细胞粘附特性。在复杂的骨折微环境中，HMPs缓慢释放Agomir-29a-Exos，促进损伤部位的新骨形成和血管网络重建。聚集的HMPs为骨再生提供结构支持，并在其降解过程中逐渐被新形成的骨所取代。通过体外实验证明了miR-29a/HDAC4/RUNX2的相关性，在分子水平上证实HMP@Agomir-29a-Exo的生物学效应。体内动物实验表明，HMP@Agomir-29a-Exo能有效增强血管化，增加骨折部位的新骨形成。总之，HMP@Agomir-29a-Exo作为一种有效的注射制剂，有可能成为一种新的骨折和骨缺损再生修复治疗策略。
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