在生命科学研究的微观世界里，超分辨显微镜的出现为我们打开了一扇全新的大门，让我们得以窥探细胞内部那些曾经难以触及的细节。而 HIS - SIM 作为超分辨成像领域的一款利器，在活细胞成像，尤其是线粒体成像方面展现出了独特的魅力，其拍摄出的线粒体超分辨图像，以令人惊叹的清晰度，为科研工作者揭示了线粒体的神秘结构和动态变化。然而，在这看似完美的成像背后，也隐藏着一些值得深入探讨的问题，比如图像工作站后期处理以及 Mitotracker 的特异性等。

自 1873 年德国物理学家恩斯特・阿贝提出光学显微镜存在分辨率极限以来，这一限制就像一道难以逾越的鸿沟，制约着人们对微观世界的进一步探索。根据阿贝极限理论，光学显微镜受限于光的衍射效应和光学系统的有限孔径，其分辨率极限约为 200nm 。这意味着尺寸在 200nm 以内的生物结构，如线粒体内部的一些精细结构，使用传统光学显微镜无法清晰观察。在成像时，若使用波长为 400nm 的光，并采用空气（折射率为 1）作为物镜和样本之间的介质，通过分辨率极限公式计算可得分辨率极限为 200nm。光学显微镜的分辨率决定于光学系统中聚焦光斑（艾里斑）的尺寸，当一个艾里斑的边缘与另一个艾里斑的中心正好重合时，对应的两个物点刚好能被人眼或光学仪器所分辨（瑞利判据） 。

为了打破这一极限，超分辨光学成像技术应运而生，成为本世纪光学显微成像领域最重大的突破。超分辨光学成像技术主要有两种实现途径 。一种是基于特殊强度分布照明光场的超分辨成像方法，典型的如受激发射损耗显微镜技术（STED） 。该技术的成像理论来源于爱因斯坦的受激辐射理论，一个典型的 STED 显微镜需要两束严格共轴的激光，一束激发光使艾里斑范围内的荧光分子被激发，电子从基态跃迁到激发态；随后，甜甜圈型的损耗光照射样品，使处于激发光斑外围的激发态分子以受激辐射的方式释放能量回到基态，而位于激发光斑内部区域的激发态分子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态，从而将荧光发射区域限制在小于艾里斑的区域内，获得小于衍射极限的荧光发光点，通过扫描实现超分辨成像。

另一种是基于单分子成像和定位的方法，如光激活定位显微镜技术（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM） 。以 PALM 为例，其利用单分子定位算法，通过控制荧光分子的活化和漂白，在艾里斑内高精度找到大量荧光分子的中心位置，从而重建出超分辨图像。这些超分辨成像技术的出现，使得光学显微镜能够突破 200nm 的分辨率极限，为生命科学研究提供了前所未有的工具。

HIS - SIM（High Intelligent and Sensitive SIM）是超视计科技针对单细胞荧光显微成像应用而自主研发生产销售的一款通用型超分辨显微镜，其核心技术源自于北京大学生物光学成像前沿交叉团队。HIS - SIM 具有诸多卓越的特性，使其成为活细胞超分辨成像的首选工具 。

在空间分辨率方面，HIS - SIM 的分辨率优于 60nm，这意味着它能够清晰地展现活细胞内的所有标记物及其分布情况，让科研人员能够一览无余活细胞内的微观世界。在成像速度上，其最快可达 1500fps，如此高的帧频能够高速捕捉活细胞内的各种互作和动态过程，比如活细胞囊泡分泌孔道和中间态过程都能被精准捕捉。100 倍下具有 150μm 的超大视野，这一特点使得它能够全面覆盖细胞互作 - 细胞器互作的跨尺度全景观测，从多细胞区域到细胞器层面的动态过程都能被有效观测。

HIS - SIM 还具备超低光毒性，这对于活细胞长时程观测至关重要。其成像原理、成像系统以及图像算法的优化，造就了超低光毒性，能够连续拍摄活细胞多通道过夜、跨夜实验，并且可以边拍边存，保证了实验数据的完整性和连续性。此外，它还拥有长时程 xyz 实时智能追踪功能，能够解决长时程成像样本引起的失焦和视野偏移问题，为各类活细胞超分辨长时程成像保驾护航 。同时，多达 25 种成像模式满足了不同样本的超分辨观测需求，全面适配 brightfield/widefield/tirf/2d - sim/tirf - sim/3d - sim 等多种成像场景。

线粒体作为细胞的 “能量工厂”，对细胞的正常生理功能起着关键作用。其结构和功能的异常与多种疾病的发生发展密切相关 。HIS - SIM 在拍摄线粒体超分辨图像时展现出了巨大的优势。凭借其超高的分辨率，能够清晰地分辨线粒体内嵴等精细结构，实时所见的 24hz 实时超分辨功能，还能提高成像成功率和实验效率，一键实时预览即可分辨线粒体内嵴，快速定位感兴趣区域（ROI） 。通过 HIS - SIM 拍摄的线粒体超分辨图像，科研人员可以更准确地研究线粒体的形态、分布以及与其他细胞器之间的相互作用，为深入了解线粒体的功能和相关疾病的发病机制提供了有力的支持。

当使用 HIS - SIM 完成活细胞线粒体成像后，图像工作站的后期处理是一个不可或缺的环节。虽然 HIS - SIM 拍摄出的原始图像已经具有很高的清晰度和分辨率，但后期处理能够进一步挖掘图像中的信息，提高图像的质量和可分析性 。在成像过程中，由于各种因素的影响，如样本的不均匀性、光线的干扰、仪器的噪声等，原始图像可能存在一些瑕疵或不完美之处。后期处理可以对这些问题进行校正和优化，使图像更加清晰、准确地反映线粒体的真实结构和特征。

图像降噪是后期处理的重要步骤之一。成像过程中产生的噪声会影响图像的清晰度和细节表现，通过各种降噪算法，可以有效地去除噪声，提高图像的信噪比。图像增强技术可以增强图像的对比度和亮度，使线粒体的结构更加突出，便于观察和分析 。在处理线粒体超分辨图像时，可能需要对图像进行分割，将线粒体从背景和其他细胞器中分离出来，以便更准确地测量线粒体的形态参数，如面积、周长、长宽比等 。通过图像配准技术，可以将不同时间点或不同条件下拍摄的线粒体图像进行对齐，从而更好地观察线粒体的动态变化过程。

Mitotracker 是一种常用于标记线粒体的荧光探针，其原理是基于线粒体膜电位的存在。Mitotracker 带有正电荷，能够被线粒体膜电位吸引，从而特异性地进入线粒体，并在其中积累发出荧光，使得线粒体在荧光显微镜下能够被清晰地观察到 。在活细胞成像中，Mitotracker 被广泛应用于标记线粒体，以便研究线粒体的形态、分布和功能。

虽然 Mitotracker 在标记线粒体方面具有一定的特异性，但它的特异性并没有那么高，这也是在使用过程中需要关注的问题 。在某些情况下，Mitotracker 可能会出现非特异性染色，即除了线粒体之外，还可能会标记到其他细胞器或细胞结构。细胞的生理状态发生改变时，如在疾病状态下，线粒体膜电位可能会发生异常变化，这可能导致 Mitotracker 的摄取和分布发生改变，从而影响其标记的特异性 。一些药物或化学物质的处理也可能干扰 Mitotracker 与线粒体的结合，导致非特异性染色的出现 。此外，不同类型的细胞对 Mitotracker 的摄取和反应也可能存在差异，这也增加了其特异性的不确定性。

为了提高 Mitotracker 标记的准确性和特异性，科研人员通常会采取一些措施 。可以结合其他标记方法进行验证，如使用针对线粒体特定蛋白的抗体进行免疫荧光标记，与 Mitotracker 标记结果相互印证，以确定标记的准确性 。优化实验条件，控制好 Mitotracker 的浓度、孵育时间和温度等参数，以减少非特异性染色的发生 。在数据分析阶段，也需要谨慎对待，综合考虑各种因素，避免因 Mitotracker 的非特异性染色而得出错误的结论。

HIS - SIM 为线粒体超分辨成像提供了强大的技术支持，让我们能够以前所未有的清晰度观察线粒体的微观世界。但在使用过程中，我们也需要充分认识到图像工作站后期处理的重要性以及 Mitotracker 特异性的局限性，通过合理的后期处理和严谨的实验设计，确保我们能够从这些超分辨图像中获取准确、可靠的信息，为生命科学研究的深入发展贡献力量。随着技术的不断进步，相信未来超分辨成像技术将在线粒体研究以及其他生命科学领域发挥更加重要的作用，为我们揭示更多生命的奥秘。