诱导多能干细胞（iPSC）能够分化成各种细胞类型，具有作为通用型细胞治疗产品的潜力，可能成为细胞疗法的革命性工具1。在最新的研究进展中，iPSC衍生的iNK和iT细胞在动物模型和临床试验中均表现出对癌细胞的强大杀伤力1。

本期推文中，我们将通过近期发表的文献1，概述12种设计iPSC的策略，并介绍当前基于细胞的免疫疗法的局限性和挑战。文末更有多能干细胞定向分化的精美挂图，直观全面的了解多能干细胞向生殖细胞、内胚层、中胚层和外胚层的不同分化路径。

免疫疗法简介在过去十年中，CAR-T细胞免疫疗法的出现显著改变了癌症治疗领域，该疗法已成为与手术、放疗和化疗等传统疗法齐名的关键治疗方式。然而，FDA批准的自体CAR-T疗法存在诸多局限性，例如成本、供体差异和制造所需时间，这些都被视为阻碍CAR-T疗法广泛应用的“拦路石”。而iPSC有可能成为低成本、高质量、通用的工程化疗法来源，其具有规模化放大的潜能并能最大程度的保持产品质量的一致性。

自然杀伤细胞

自然杀伤（NK）细胞是一种可通过细胞毒性机制杀死靶细胞的免疫细胞。与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞可能具有一些显著优势：(1) 安全性更高（无神经毒性或细胞因子释放综合征，可避免移植物抗宿主病GvHD）；(2) 有多种方式触发细胞毒性；(3) 很可能实现“现货”生产。CAR-NK细胞的开发代表了免疫疗法领域一个令人兴奋的前沿，它有可能克服当前CAR-T细胞疗法的局限性，为患者提供更易获得、更有效的治疗选择。

巨噬细胞

对于实体瘤，巨噬细胞可以有效地渗透到肿瘤中，并且在肿瘤微环境（TME）中大量存在。作为主要的免疫调节剂，CAR-巨噬细胞可以将冷TME（不存在T细胞和促炎细胞因子）转变为热TME（存在T细胞和促炎细胞因子），并吸引和激活适应性免疫细胞，可以直接杀死肿瘤细胞。

树突状细胞

树突状细胞是一种特殊类型的吞噬细胞，可呈递抗原以连接先天性和适应性免疫。树突状细胞在诱导对病原体和肿瘤的免疫反应以及维持自身耐受性方面至关重要。

表1 当前CAR-T、NK和巨噬细胞免疫疗法的特征和比较

iPSC衍生的iNK细胞和iT细胞的获取和工程化

iPSC分化为免疫细胞是一个多步骤过程。首先，iPSC在拟胚体（EB）中经历中胚层诱导，此时多能性相关基因表达丧失，中胚层基因表达增加，形成多能祖细胞。接着诱导生成造血祖细胞（HPC）并产生能够分化为各种细胞谱系的细胞群（图1）。

图1 iPSC分化为免疫细胞

HPC产生常见淋巴祖细胞（CLP），随后在特定的一组因子和细胞外基质作用下形成iNK或iT细胞。为了分化为iPSC衍生的巨噬细胞（iMAC），需要将漂浮的EB重新接种以附着在培养容器上。这会产生髓系工厂，从而产生祖细胞巨噬细胞，然后再与特定细胞因子孵育后成熟为M1或M2巨噬细胞。对于iPSC衍生的树突状细胞 (iDC)，HPC通过暴露于多种生长因子而产生CD11c+ DC。这些细胞类型在临床前和临床环境中处于不同的研究阶段，其中iNK细胞已证明在治疗血液系统恶性肿瘤中具有临床疗效。

iPSC工程用于下一代iNK、iT细胞

为了克服CAR-T或CAR-NK细胞在免疫治疗中的挑战和局限性，研究者提出了12种策略来设计iPSC，使其具有安全开关、“隐身编辑”、特定靶向、避免GvHD、淋巴细胞耗竭、体内持久性、有效分化、T细胞干性、代谢适应性、归巢/运输、克服抑制性肿瘤微环境和基质细胞屏障。

图2 下一代iNK、iT细胞的12种工程策略01安全开关

安全开关提供了一种在发生不良事件时消除输注细胞的机制，从而提高了这些疗法的安全性。细胞疗法中使用了几种类型的安全开关，总结如表2。

表2 不同安全开关类型的总结02隐身编辑

人类白细胞抗原（HLA）基因在移植物排斥中起着至关重要的作用。受体和移植物HLA I类和II类基因之间的差异可分别导致宿主CD8+和CD4+ T细胞的激活，从而直接杀死移植物细胞。研究人员正在研究编辑T细胞或NK细胞上的HLA表达的方法，使其在免疫学上保持沉默并逃避宿主抗移植物（HvG）反应，有时称为“隐身”。

表3 细胞治疗中“隐身编辑”策略的特点

03避免GvHD

当具有免疫功能的供体T细胞将受体宿主识别为外来者时，它们会启动针对同种异体抗原携带细胞的免疫反应，导致宿主组织死亡和GvHD。T细胞活化依赖于TCR的抗原识别。TCR由多个亚基组成，包括α链和β链。敲除α链，TCR失去功能，这意味着T细胞无法有效识别和攻击宿主组织。这可能会降低同种异体细胞移植后GvHD的发病率和严重程度。

04CAR插入用于特异性靶向和hnCD16

NK细胞表达激活的免疫球蛋白γ Fc受体CD16a，该受体可识别附着于靶细胞的IgG抗体的Fc部分。用高亲和力CD16变体（F158V）和单克隆抗体治疗的患者表现出增强的抗肿瘤反应。第二个Fc受体CD64与IgG的结合亲和力是CD16的30倍。表达CD64胞外结合区和CD16a跨膜胞内结构域融合受体的iNK与抗HER2曲妥珠单抗或抗EGFR1西妥昔单抗抗体联合使用时可有效杀死癌细胞。CD64的更高亲和力使单克隆抗体能够预先吸附到表达重组CD64的NK细胞上，从而无需额外抗体即可改善肿瘤靶向性。

05淋巴细胞清除

淋巴细胞清除是接受造血干细胞移植的患者的一个必要过程，以便为移植细胞腾出空间。CD52在成熟的T和B淋巴细胞中高度表达，而在其他血细胞（如单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞）中的表达较低。重要的是，CD52不在CD34+ HSC上表达。因此，使用消耗性的抗CD52抗体将特异性地靶向目标淋巴细胞（B细胞和T细胞），同时保留重新填充血液区室所需的关键HSC。

06高效iT、iNK分化的新策略

有研究揭示了表观遗传调节因子在确定性造血和淋巴发育过程中的关键作用。在胚胎造血发育过程中，EZH1是确定性淋巴定型的关键负调节因子，EZH1敲低T细胞显示 CD3+TCRαβ+ T细胞显著增加，CD3+TCRγδ+ T细胞显著减少，表明EZH1敲低促进向αβ T细胞而非γδ T细胞分化，并表现出更成熟的T细胞表型、高度多样化的T细胞受体 (TCR) 库和增强的抗肿瘤活性。

07提高iT干性

T细胞疗法的有效性受到T细胞快速耗竭和死亡的限制。因此，提高T细胞疗法疗效的一种策略是提高细胞的“干性”，即提高细胞自我更新和分化成不同类型T细胞的能力。T细胞干性在很大程度上取决于IL-7与其受体IL-7R之间的相互作用。在过度表达IL-7R的TIL中，与干细胞相关的基因上调，而与衰竭相关的基因下调。此外，IL-7R高TIL表达的抗凋亡分子BCL2数量明显较高，并且凋亡较少。

08增加iNK在体内的持久性

IL-15在NK细胞分化和存活中起着至关重要的作用，它通过维持Bcl-2等抗凋亡因子的表达来促进这些细胞的存活。与未转导 (NT) NK细胞相比，用编码抗CD19 CAR和IL-15的第四代载体转导的CB-NK细胞在体内扩增更快，持续时间更长。

09提高代谢适应性

CD38是一种具有NAD+糖原水解酶的酶，它的表达可导致NAD+耗竭和免疫细胞衰竭。CD38是一种多功能胞外酶，通过代谢NAD+和介导烟酰胺二核苷酸 (NAD+) 和细胞外核苷酸稳态以及细胞内钙信号传导在代谢中发挥作用。

10增加归巢/渗透

CAR-T或CAR-NK细胞在肿瘤部位的运输和滞留对于最佳抗肿瘤效果至关重要。NK细胞诱导CCR7表达可改善NK细胞向淋巴结相关趋化因子CCL19的迁移和归巢，从而对抗血液系统恶性肿瘤。

11克服抑制性TME

肿瘤微环境（TME）由严酷的代谢环境组成，其特点是存在各种免疫抑制代谢物、缺氧、酸性、转化生长因子 β (TGFβ) 上调以及葡萄糖和氨基酸缺乏。由于TGFβ在TME中起抑制作用，因此已被用于增强细胞疗法的抗肿瘤反应。

12克服基质细胞的物理障碍

肿瘤基质的细胞外基质（ECM）可阻止治疗药物渗入肿瘤，为癌症治疗形成物理屏障。ECM由各种结构分子组成，例如纤维蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖。这些分子由肿瘤和癌症相关成纤维细胞（CAF）产生，有助于肿瘤发生。成纤维细胞活化蛋白（FAP）是一种在CAF中高度表达的膜蛋白酶。目前正在研究克服屏障基质细胞的策略是使用CAR-T细胞靶向FAP。

总结iPSC衍生的iNK和iT细胞是免疫治疗领域一条充满希望的新途径。这些细胞为治疗从癌症到自身免疫性疾病等各种疾病带来了希望。随着研究的不断深入和技术的进步，基于iPSC的方法将彻底改变肿瘤学和再生医学，在未来几年内有望改善患者的治疗效果并带来新的治疗标准。

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参考文献

1.Fang M, Allen A, Luo C, Finn JD. Unlocking the potential of iPSC-derived immune cells: engineering iNK and iT cells for cutting-edge immunotherapy. Front Immunol. 2024;15:1457629. Published 2024 Aug 30. doi:10.3389/fimmu.2024.1457629

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