胰酶成分

胰酶主要由胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶组成。市面上的商品胰酶一般都会加入EDTA和酚红等成分，但针对不同的情况，有特殊的胰酶如去除EDTA和酚红等。

胰酶对细胞的影响

胰蛋白酶对细胞的影响

作用机制：胰蛋白酶作为一种异种蛋白酶，能选择性地水解精氨酸或赖氨酸构成的肽链，将细胞膜上和培养皿结合的蛋白质溶解，使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。

影响因素：胰酶分散细胞的活性与浓度、温度和作用时间有关。在 pH 为 8.0、温度为 37℃时，胰酶溶液的作用能力强。同时，Ca²⁺、Mg²⁺和血清、蛋白质可降低胰酶的活性。

EDTA 与胰酶的协同作用

EDTA 可络合 Ca²⁺，与胰酶起到协同消化的作用，增加消化效力。但对细胞贴壁性有影响，使用时需谨慎。

注意事项：血清可终止胰酶的作用，但不能终止 EDTA 的作用。对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。例如，在配制胰酶时加入 EDTA 可提高胰酶消化能力，缩短消化时间，但如果影响贴壁，在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除 EDTA；如果对贴壁没影响，可不离心。在做细胞凋亡检测时，不适合用含有 EDTA 的胰酶，可以使用物理方法对细胞进行脱壁处理，因为 Annexin V 常用于细胞凋亡检测，是一种钙离子依赖的蛋白，EDTA 会螯合钙离子从而影响 Annexin V，进而影响结果。

胰酶消化的注意事项

向培养瓶中加入适量胰酶，轻轻摇晃培养皿使胰酶铺满，注意不可消化过久，消化过久对细胞有害。消化细胞的操作步骤对细胞传代后的状态有很大影响，如果胰酶过量或消化时间过长，会导致细胞传代后活力减弱或直接导致细胞死亡。所以消化细胞时要严格控制胰酶使用量及消化时间。

胰酶消化过度的后果及应对

消化过度

细胞会成片脱落，这是因为胰酶过度消化使得细胞间的连接被破坏，细胞无法正常贴壁生长。同时，胰酶消化过度会提高细胞的凋亡率，严重影响细胞的活性和生存状态。在肿瘤组织原代细胞分离时，可考虑使用胶原酶，其对细胞的损伤更小。胶原酶能够特异性识别并水解胶原蛋白，对细胞间质有较好的消化作用，同时对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。

胰酶消化时间长

可以在加入胰酶消化前先用 PBS 冲洗培养瓶。这样可以去除残留的杂质和可能影响胰酶消化效果的物质，提高胰酶消化能力，缩短消化时间。

不贴壁的情况

对于长久不贴壁的细胞，可静置 12 小时或更长时间后观察。在此期间，细胞可能会逐渐适应环境并开始贴壁生长。同时，要检查胰酶中是否有 EDTA。如果有 EDTA 且影响贴壁，可重新配制不含 EDTA 的胰酶。对于不贴壁的细胞，也可以适当缩短胰酶消化时间或降低胰酶浓度，避免消化过度。此外，还可以换用新的培养皿或者培养瓶，确保培养环境干净无污染。