LncRNA的功能研究

LncRNA研究中非常关键的一步就是发现特定的lncRNA;前文中介绍到通过组学数据和数据库的多方位筛选，根据研究目的筛选出候选lncRNA，针对筛选后的lncRNA，需要进一步的功能验证，验证lncRNA的调控机制。LncRNA的保守性较低，可以通过序列分析评估研究物种和模式物种中具有保守功能的lncRNA，同时因为不同物种间序列相似度不高的lncRNA，也可能具有保守的功能;因此进行lncRNA保守性分析的时候不能简单分析蛋白质编码基因的研究范式进行保守性分析，需要结合共线性、短读基序以及RA二级结构等信息鉴定保守的lncRNA。

验证lncRNA的调控机制，需要对lncRNA进行体外或体内验证，研究作用分子的变化情况及对研究样本的功能调控影响;对于lncRNA的验证来说，其核心流程主要为：验证lncRNA真实存在-验证lncRNA的表达水平-验证lncRNA的功能，综上主要包括如下几个大类：

体外实验功能验证&体内实验验证

1. LncRNA检测：qPCR、FISH等，因为lncRNA表达量较低，因此需要选择合适的试剂盒和尽可能挑选表达量高的lncRNA进行验证;

2. LncRNA功能验证：RNA pull down、CLIP-seq、ChIRP-seq、RIP-seq;

3. 功能获得性/缺失性研究：过表达载体或RNAi。

4. 动物模型功能实验：构建动物模型，导入过表达载体，检测动物表型变化、生化指标和相关基因表达。

LncRNA的影响机制

LncRNA鉴定和保守性分析

LncRNA检测主要是验证发现的lncRNA是真实存在的，并验证lncRNA的表达水平存在差异：可以通过sanger测序验证lncRNA存在的真实性，通过qPCR、northern-blot验证RNA的表达丰度并验证序列信息。

（1）qPCR定量

由于lncRNA在不同细胞位置（细胞核和细胞质）具有不同的功能特征，因此一般需要进行核质分离后分别进行qPCR定量，根据细胞膜和核膜裂解的难易程度不同，采用不同强度的裂解液裂解细胞，以达到细胞质和细胞核互相分离的目的，选择已明确定位的RNA，如GAPDH、ACTB、U6等进行检测确定核质分离效果。核质分离的分析中一般不需使用内参基因进行校正，最后直接使用2-ΔCt进行计算得到目的基因胞质含量与胞核含量的比例。

胞质分离的IncRNA定量

（2）保守性分析

LncHOME基于CPAT预测isoform的编码能力过滤蛋白编码基因，并结合上述鉴定到的lncRNA，得到最终的lncRNA数据集：首先基于基因组共线性鉴定同源lncRNA（随机森林模型）;然后基于功能保守性和共线性鉴定同源RNA，使用RBO全基因组结合位点的数据，找到RNA序列中的motif信息;最后在不同物种中（研究物种和模式物种间）与响应保守的lncRNA发生互作的RBP取交集，即保守的lncRNA都受到相似的RBP调节。

LncRNA的保守性分析

LncRNA功能验证

LncRNA发挥作用一般是与DNA/RNA/蛋白等相互作用，同时存在细胞质和细胞核中定位的区别，细胞核内的LncRNA主要参与转录调控，细胞质内的LncRNA参与转录后调控，借助FISH（原位杂交）可以确定lncRNA在细胞中的位置，借助功能缺失/获得实验可以进一步观察lncRNA对细胞功能的影响，借助RNA pull down & RIP-seq可以验证lncRNA与一些蛋白的相互作用。

（1）鱼

FISH通过将特定标记的核酸探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，提供RNA在单个细胞内的定位，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位。

LncRNA的FISH细胞定位

（2）功能缺失/获得实验

利用siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，观察干预后对细胞增殖、凋亡、侵袭、转移、染色体等的影响，可以验证lncRNA靶基因的表达情况;构建lncRNA过表达载体，观察过表达后lncRNA对细胞功能的影响，可以验证lncRNA的表达情况。基于CRISPR的基因敲除和筛选系统，可以鉴定同源lncRNA在不同物种中的保守功能。

功能性丧失一般采用如siRNA、shRNA、反义核酸以及CRISPR/Cas9等，来实现对LncRNA的沉默。这些方法的应用能够有效地降低LncRNA的表达水平。在沉默之后，我们可以通过qRT-PCR或FISH等技术来验证LncRNA的表达水平是否降低。同时，我们还需要观察这种降低对疾病相关基因表达以及细胞表型等的影响。

功能性获得性研究LncRNA 过表达质粒或者慢病毒、腺病毒包装载体。基本原则是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上，从而实现lncRNA的过表达。然而，对于某些较大或其全长尚未分离的lncRNA，我们将根据其在基因组上的定位采取不同的研究策略。在构建lncRNA表达质粒时，我们需要关注lncRNA是否在蛋白编码基因的启动子区域或3′-UTR区域，以防止遗漏任何重要的区段。

LncRNA功能获得/缺失实验

LncRNA相互作用

基因表达受转录和转录后水平的调控，受DNA结合蛋白、RNA结合蛋白及非编码RNA控制。LncRNA被发现可参与转录、mRNA代谢以及蛋白稳定性的调控，大部分LncRNA通过与DNA结合蛋白及RNA结合蛋白相互作用行使其调控功能。推测lncRNA可能与一些蛋白结合调控DNA/RNA的功能，可以设计探针利用免疫磁珠富集lncRNA，富集产物分离蛋白，质谱鉴定结合产物;或者在上述实验操作流程的基础上，已知某个蛋白与RNA结合，可以采用抗体富集蛋白，分离RNA，对RNA进行测序。

（1）RNA下拉

RNA pull down：通过生物素特异性标记的lncRNA探针与胞浆蛋白提取液进行联合孵化，形成LncRNA-蛋白质复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而达到分离效果。随后对复合物进行洗脱纯化，通过Western Blot实验检测特定的蛋白是否与LncRNA相互作用，也可以进行质谱检测。

LncRNA的RNA pull down流程和结果示例‍

（2）ChIRP-seq

在活细胞状态时，细胞交联形成LncRNA-染色质复合物，超声打断染色质，探针与LncRNA杂交，亲和素磁珠纯化LncRNA及其结合的染色质片段，测序分析结果。纯化RNA获得其结合的染色质片段（包括蛋白、DNA和RNA）。

LncRNA的ChIRP-seq流程和结果示例

LncRNA表达蛋白验证

起源基因

从lncRNA表达蛋白的角度，完成对lncRNA功能的阐释;上文中讲到部分lncRNA可以进行翻译产生蛋白短链或者微肽。

首先需要先分析lncRNA是否存在sORF，然后对具有sORF的候选lncRNA进行蛋白表达和多肽表达的鉴定。

LncRNA的sORF预测

参考文献

1）Mattick J S， Amaral P P， Carninci P， et al.长链非编码RNA的定义、功能、挑战与建议[J].自然评论分子细胞生物学， 2023， 24（6）： 430-447.

2）程R， 李芳， 张明， 等.一种由lncRNA编码的新型蛋白RASON控制KRAS突变型癌症的致癌RAS信号传导[J].细胞研究， 2023， 33（1）： 30-45.

3）黄伟， 熊婷， 赵妍， 等.计算预测和实验验证识别斑马鱼到人类的lncRNAs功能保守[J].自然遗传学， 2024： 1-12.

4）Zhang L， Xu W， Gao X， et al. RNAi病毒抑制因子的lncRNA感知激活果蝇非经典先天免疫信号传导[J].细胞宿主与微生物， 2020， 27（1）： 115-128.E8的。

5）Zheng C， Wei Y， Zhang P， et al. CRISPR/Cas9筛选揭示了人类癌症中隐秘lncRNA编码的开放阅读框的功能翻译[J].临床研究杂志， 2023， 133（5）.

6）Barnes C， Kanhere A. 体外RNA下拉法鉴定RNA-蛋白质相互作用[J].Polycomb Group 蛋白质：方法和协议，2016：99-113。

7）Chu C， Qu K， Zhong F L， 等.长链非编码RNA占据基因组图谱揭示了RNA-染色质相互作用的原理[J].分子细胞， 2011， 44（4）： 667-678.