上海埃泽思生物科技有限公司

多能干细胞(ES/iPS)冻存是干细胞扩增传代过程中重要的一环，但是多能干细胞不同于普通细胞系，其增殖扩增过程中需要聚团生长，为保持其细胞活性，不建议单细胞传代。而且使用血清+DMSO冻存方法，不能很好的保持细胞活性，且复苏细胞成活率较低。本文就重点介绍多能干细胞进行冻存以及解冻的标准化步骤。

介绍使用AppliedCell™ 多能干细胞培养基以及Advance多能干细胞培养基培养的细胞，

本方法适用于AppliedCell™ 多能干细胞培养基以及Advance多能干细胞培养基培养的细胞（同样适用于mTesR以及E8系统培养的细胞），冻存以及复苏前后，应当使用同一种培养基，复苏传代后可以更换其他培养体系。

Serum-Free干细胞冻存液（AC-1001011/12）是埃泽思生物专为ES/iPS  细胞设计的的一款化学成分确定，无血清，无动物源成分，且无需程序降温的高效冻存液。具体冻存及复苏操作方法如下：

1、冻存：以下操作方法以6孔板为例：

（1） Serum-Free干细胞冻存液为即拿即用，且4℃保存，冻存液拿出后应快速放回4℃；

（2）使用多能干细胞消化液（AC-1001008）消化细胞；

（3）收集细胞，室温300×g离心5分钟；

（4）小心吸掉上清液，不要干扰细胞团；

（5）用1mL冻存液重悬细胞，并均匀分装到冻存管中

采用非程序降温法，将冻存管直接放入-80℃冰箱中，冻存24h后转移至液氮中长期保存。

2、解冻

预先包被细胞培养板，人ES和iPS细胞解冻后应立即接种到培养板中。

（1）多能干细胞培养基/Advance 多能干细胞培养基室温平衡15-30min,不能37℃加热;

（2）在水浴锅中持续晃动冻存管，37℃水浴锅中快速解冻细胞，直至细胞完全融化；

（3）取出冻存管，用70％乙醇擦拭冻存管表面；

（4）准备15mL离心管，预先加入5mL多能干细胞培养基，将细胞悬浮液缓慢逐滴至15mL离心管中，尽量保持细胞聚团状态。

（5）在室温300×g离心5分钟。

（6）吸掉上清，注意不要干扰细胞沉淀。使用1mL多能干细胞培养基轻轻地重悬细胞3-5次，不要破坏细胞聚团状态。

（7）分别取0.5mL细胞悬液，均匀接种到包被好的6孔板的2个孔中，并分别补充多能干细胞培养基至2m。

（8）置于37°C细胞培养箱中。在前后左右呈十字形摇动培养板板5次，以均匀分散细胞。

（9）每天更换培养基，并显微镜下观察细胞状。