在细胞生物学研究中，常常需要在细胞中外源性过表达特定的基因，以研究其功能和作用机制。293T 细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，具有易于转染、生长迅速等优点。本文将介绍如何在 293T 细胞中外源性过表达两种质粒，以及转染体系的配制方法。

一、实验材料

293T 细胞

两种待过表达的质粒

转染试剂（如 Lipofectamine 2000 等）

细胞培养基（如 DMEM 培养基等）

血清（如胎牛血清等）

抗生素（如青霉素、链霉素等）

无菌 PBS 缓冲液

无菌离心管、移液器等实验器材

二、实验步骤

细胞培养在 37℃、5% CO₂的培养箱中，用含 10% 胎牛血清和 1% 抗生素的 DMEM 培养基培养 293T 细胞。当细胞生长至 70%-80% 汇合度时，进行传代或用于转染实验。

质粒准备提取并纯化两种待过表达的质粒，确保质粒的质量和纯度。用无菌 PBS 缓冲液或无核酸酶的水将质粒稀释至适当浓度。

转染体系配制根据转染试剂的说明书，确定所需的转染试剂和质粒的用量。一般来说，转染试剂与质粒的比例会因不同的试剂和细胞系而有所差异。例如，使用 Lipofectamine 2000 进行转染时，可以按照以下方法配制转染体系：在无菌离心管中，加入适量的无血清培养基，然后加入一定量的转染试剂，轻轻混匀，室温静置 5 分钟。在另一个无菌离心管中，加入适量的无血清培养基，然后加入适量的两种质粒，轻轻混匀。将含有质粒的培养基缓慢加入含有转染试剂的培养基中，轻轻混匀，室温静置 20 分钟，使转染复合物形成。

细胞转染将 293T 细胞用无菌 PBS 缓冲液洗涤两次，然后加入适量的无血清培养基。将配制好的转染复合物缓慢加入细胞中，轻轻混匀。将细胞置于 37℃、5% CO₂的培养箱中培养 4-6 小时。更换为含 10% 胎牛血清和 1% 抗生素的 DMEM 培养基，继续培养 24-48 小时，以实现质粒的过表达。

三、注意事项

质粒的质量和纯度对转染效率有很大影响，因此在提取和纯化质粒时要严格按照操作规程进行，确保质粒的质量。

转染试剂的选择和使用要根据细胞系和实验目的进行优化，不同的转染试剂可能具有不同的转染效率和细胞毒性。

在配制转染体系时，要严格按照转染试剂的说明书进行操作，确保转染试剂和质粒的用量准确无误。

转染过程中要注意无菌操作，避免污染。

转染后的细胞培养条件要适宜，以确保细胞的生长和质粒的表达。

总之，在 293T 细胞中外源性过表达两种质粒需要进行精心的实验设计和操作。通过合理选择转染试剂、优化转染体系和培养条件，可以提高转染效率和质粒的表达水平，为细胞生物学研究提供有力的支持。