先导编辑（Prime Editing）系统，是美国哈佛大学刘如谦教授团队的代表性成果之一。近日，该团队的高鑫博士和同事，在此基础之上打造出一款升级版基因编辑系统。

图 | 高鑫（来源：高鑫）

这款升级版基因编辑系统，能将整个基因精准地插入细胞 DNA 中的指定位置。不需要像其他基因编辑疗法那样，必须针对每种突变进行逐一修改。

通过此，高鑫等人突破了哺乳动物细胞基因组大片段定点整合效率的瓶颈，也提升了大基因片段在哺乳动物细胞中的整合效率和精确度，为基因编辑和基因治疗带来了新的技术支持。

基于此，未来有望实现只需开发一种基因编辑疗法，即可治疗由数百种、甚至上千种不同基因突变所引起的疾病。

（来源：Nature Biomedical Engineering）

详细来说，研究中高鑫和同事利用蛋白进化的手段，针对 DNA 大丝氨酸重组酶 Bxb1 进行了酶改造。

并将 Bxb1 作为可程式化的基因插入，探索了它在致病位点的应用价值，借此提出一款名为 eePASSIGE（evolved and engineered prime-editing-assisted site-specific integrase gene editing）的先导编辑技术。

同时，也在干细胞和原代人成纤维细胞等具有药用价值的细胞系中，进行了探索。

“先导编辑辅助位点特异性整合酶基因编辑”技术（PASSIGE，prime-editing-assisted site-specific integrase gene editing）是该团队此前开发的定向基因插入技术。

美国麻省理工学院一间实验室则“通过特定站点目标元素进行可编程添加”技术（PASTE，programmable addition via site-specific targeting elements）使用先导编辑器和大丝氨酸重组酶来实现大片段的定向基因插入。

本次研究之中，课题组也探讨了 PASSIGE 技术在基因插入效率上优于 PASTE 技术的原因。

（来源：Nature Biomedical Engineering）

通过此他们证实：在目前已有的同类方法中，本次研发的 eePASSIGE 方法，具备不错的基因插入效率、以及可程式化的灵活性。

这让 eePASSIGE 能够为治疗遗传类疾病注入新希望，并有望在以下领域发挥作用：

其一，用于改造体外疗法、CAR-T 免疫细胞疗法等和新一代体内基因疗法，从而更好地治疗囊性纤维化、苯丙酮尿症、眼部疾病等。

在此前的细胞疗法之中，由于慢病毒的存在，故会在全基因组导致随机的插入风险，以及导致初代 Cas9 和其他 DNA 双链切割酶产生染色体变异。

而利用本次方法加以改造，将能避免上述问题的出现。

其二，用于实现更多的合成生物学应用。

即可以在生物活细胞内构建人工设计的基因回路，进而针对外界应激做出基因调控。

也可以通过改造细胞株来优化药用蛋白的产量。

更可以通过定向、高效地插入大型调控元件，来研究三维基因组的构象和折叠、以及研究生物体的发育问题。

其三，用于提升农作物的性状和产能。

对于改造农作物的性状来说，如何实现定向的 DNA 序列插入是一个公认的难题，而 eePASSIGE 则有希望解决这一难题。

开发全新治疗方法，解决不同种类的致病突变

据介绍，人体出现的基因突变（比如错义突变和无义突变等），会导致基因功能丧失，从而引起遗传疾病。

而对于某个会催生遗传疾病的致病突变来说，它里面又包含着许多种类。

比如：对于 PAH 基因来说，目前已知大约有 1000 个突变能导致苯丙酮尿症；对于 CFTR 基因来说，目前已知大约有 2000 个突变能导致囊性纤维化。

通常来讲，对于任何一种遗传疾病而言，不同病人的体内致病突变体，也不尽相同。

而通过开发一款精准、定向的大片段基因插入技术，就能在内源位点插入病变基因的正确序列。

这样一来，就能表达正常生理水平的基因产物，进而解决由于致病突变导致的基因功能缺失。

也就是说，只需开发一个疗法，就能治疗存在多种类型突变的绝大多数疾病。

此前，传统基因疗法主要依赖于外源病毒载体进行表达。由于缺少内源调控元件，因此很容易出现基因产物过度表达的问题，进而导致疾病的发生。

2021 年底，高鑫和同事在 Nature Biotechnology 上发表了 PASSIGE 技术的相关论文，实现了可程式化的大片段基因技术，并申请了美国专利（现已获专利批准）。

PASSIGE 的工作原理，主要涉及到两个步骤：

第一步，由先导编辑器和一对 pegRNA，在特定的基因位点导入 DNA 丝氨酸重组酶，比如导入 Bxb1 的识别序列 attB/P；

第二步，当 Bxb1 识别 attB/P 序列之后，可以将 plasmid DNA 载体插入到特定位点。

在先导编辑的帮助之下，该团队填补了 DNA 丝氨酸重组酶 Bxb1 可程式程度性较低的缺陷，从而能在人类基因组的特定位点比如 AAVS1，精准地插入 5.6-kb 的基因序列，并能实现 6.8% 的效率。

他们还发现：尽管 Bxb1 是自然界中一个衍生细菌病毒的蛋白，但是在人类细胞之中即使稳定细胞系已经包含 attB/P 序列，然而 Bxb1 的插入效率仍然只能达到大约 10-20%。

这说明：Bxb1 的 DNA 重组酶活性制约，能在人类细胞中实现更高效的大片度基因插入效率。

因此，高鑫和同事决定使用实验室开发的一种名为“噬菌体辅助连续进化（PACE，Phage-Assisted Continuous Evolution）”的蛋白进化方法，来提高 Bxb1 重组酶的插入效率。

（来源：Nature Biomedical Engineering）

研究中，高鑫遇到了这样一个问题：即那些进化出来的突变体，到底是如何提高插入效率的？

此前该领域内的学者，并没有解析出来完整的 Bxb1 蛋白多聚体结构，自然也就无法回答上述问题。

这时，AI 技术为他们带来了帮助。通过使用 AlphaFold2，他们成功预测了 Bxb1 的结构，并与其他丝氨酸重组酶家族成员的部分结构进行了比对。

（来源：Nature Biomedical Engineering）

同时，为了提高 eePASSIGE 在原代人成纤维细胞的编辑效率，他们在各种条件之下，一遍又一遍地测试 DNA donor 和浓度等，终于摸索出了最佳的实验条件。

日前，相关论文以《通过不断进化的重组酶和先导编辑在哺乳动物细胞中高效地定点整合大片段基因》（Efficient site-specific integration of large genes in mammalian cells via continuously evolved recombinases and prime editing）为题发在 Nature Biomedical Engineering（IF 26.8）。

斯姆里蒂·潘迪（Smriti Pandey）和高鑫是共同一作，刘如谦担任通讯作者[1]。

图 | 相关论文（来源：Nature Biomedical Engineering）

而实现 DNA donor 的递送，将是高鑫的下一个研究目标。他表示：“进入细胞体内的外源 DNA，很容易激活 T 细胞等人源原代细胞的防御反应，从而产生细胞毒性。”

因此，要想实现基于 eePASSIGE 的细胞疗法，就得开发和优化 DNA donor 的递送方式。

另外，要想在动物体内和病人体内实现定向大片段基因的高效插入，则需要开发基于 eePASSIGE 新型基因疗法。

所以，下一步高鑫也将结合病毒样颗粒等新型递送方式，来解决递送大分子编辑器的难点。

既不循规蹈矩，也不博人眼球

此外，本次论文的顺利发表，也离不开导师的帮忙。

高鑫表示：“因为 David（刘如谦）是美国霍华德·休斯医学研究所（HHMI，The Howard Hughes Medical Institute）的 Investigator，所以每隔一段时间可以向 HHMI 递交一些仪器申请。”

当时，高鑫代表实验室起草了一个计划，让导师帮忙申请到一台 QX ONE ddPCR 仪器。

有了这款仪器，只需一个晚上就能一次性处理 5 个 96 孔板和 480 个样品，不仅极大提高了本次课题的效率，也给组里开发大片段基因插入方法的其他项目带来了帮助。

图 | 刘如谦（来源：哈佛大学新闻网站）

多年来，高鑫所在的刘如谦实验室，在基因编辑技术开发、分子药物开发、蛋白工程改造等领域产出了不少成果。

对此，他表示：“我的导师 David 把一群拥有不同背景的研究者组合在一起，营造了一个既有创造力、又能互相协作的团队。”

“David 每天都对工作充满热情，记得有一次我和他以及合作者在开会，他开玩笑地说周中或是周末对他来说都是一样的。他的这种工作热情也影响到了我们。”高鑫继续说道。

另外，实验室对于科研课题选择上的“苛刻”，也让高鑫非常受益。

他说：“我的个人感觉是导师既不循规蹈矩，也不为了某些噱头做博人眼球的研究，这让人感觉非常的踏实。”

通常，该团队选择课题的出发点是：这个问题为何是领域内的难点？解决它能带来什么现实意义？会给学界增加怎样的新认知？能给已有技术带来什么突破？

“有时即使没有达到最终极的目标，但是期间所累积的观察和结果，也有可能产出一篇不错的论文。”高鑫表示。

另据悉，高鑫的硕士和博士分别毕业于美国西北大学和美国马萨诸塞州大学医学院埃里克·桑特海默（Erik Sontheimer）教授课题组。2020 年，高鑫加入哈佛大学刘如谦课题组成为一名博士后。

他说：“在加入这里之前，我就被这里的蛋白进化系统、应用单碱基编辑和先导编辑技术所吸引。”

在刘如谦课题组里，他和同事先后开发了 PASSIGE 技术和本次的 eePASSIGE 方法。

“未来我很期待可以继续在技术开发和应用上突破，将专利授权给一些药企公司，从而将这些技术转化成药品，通过治愈遗传疾病病人的病痛，为这些家庭带去希望。”高鑫最后表示。

参考资料：

1.Pandey, S., Gao, X.D., Krasnow, N.A.et al. Efficient site-specific integration of large genes in mammalian cells via continuously evolved recombinases and prime editing. Nat. Biomed. Eng (2024). https://doi.org/10.1038/s41551-024-01227-1

运营/排版：何晨龙