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自然骨具有自我修复能力，但对于因创伤、肿瘤、先天性异常和骨关节炎导致的大型或难治性骨缺损，其自身修复能力不足以实现完全的功能恢复。模仿骨组织对于促进骨再生和修复具有重要意义。自然骨（脊椎动物）含有约25 wt%的有机基质、约65 wt%的无机矿物（主要是HAP）和约10 wt%的水分。有机基质由85 - 90 wt%的胶原纤维（主要是I型胶原）和10 - 15 wt%的非胶原蛋白大分子（通常是高度负电荷的糖胺聚糖）组成。具有独特三螺旋结构的I型胶原调节形态和机械性能，而非胶原蛋白大分子在生物矿化系统中对磷酸盐晶体的成核和生长起着关键作用。骨组织是一种具有奇妙功能的自然生物矿化材料。受自然骨的结构成分和层次排列的启发，可以制造出具有相似成分和组织的生物矿化有机 - 无机杂化复合材料，以展现出与生理骨骼相似的机械性能和骨传导性。

来自武汉纺织大学的陶咏真等团队基于明胶和黄原胶衍生物的可注射及载药水凝胶通过生物矿化作用形成了具有骨传导性和抗生素可控释放能力的有机-无机杂化复合材料，旨在诱导骨骼生成。明胶经过酰胺化处理得到甲基丙烯酸明胶（GM），以支持细胞黏附和光交联能力。黄原胶则通过化学改性获得带高负电荷的羧化硫酸酯化衍生物（CMXG和SXG），以模拟骨骼中的软骨素硫酸盐。GM与CMXG/SXG以及环丙沙星盐酸盐（CPFXH）共同溶解，并在锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸酯（LAP）的作用下进行光交联，制备出载药的CMXG/SXG-GM-CPFXH-LAP水凝胶。该水凝胶具有1.30±0.03的溶胀比，并能在PBS中对CPFXH实现24小时的可控释放。经过7天矿化的CMXG/SXG3-GM12-CPFXH-LAP水凝胶显示出致密的矿物层，其钙磷原子比为1.79，结晶度为77.3%，矿物含量为50.8%，并且剪切模量是原始水凝胶的2.6倍。这种可注射、可矿化、生物相容且载药的CMXG/SXG-GM-CPFXH-LAP水凝胶由于能促进骨传导性、招募细胞并减轻炎症，因此在骨组织工程中具有广阔的应用前景。相关工作以题为“Injectable and drug-loaded gelatin methacrylate and carboxymethylated-sulfated xanthan gum hydrogels as biomimetic mineralization constructs”的文章发表在2025年02月03日的期刊《Carbohydrate Polymers》。

【明胶甲基丙烯酸酯和羧甲基化黄原胶的化学结构】

明胶通过与甲基丙烯酸酐的化学反应进行修饰，以获得GM，如已报道的方案所述。黄原胶通过与一氯乙酸的化学反应进行修饰，黄原胶（XG）链中糖单位的羟基被羧甲基取代，以得到CMXG。GM和CMXG的合成过程如图1a和b所示。在明胶和GM的ATR光谱中（图1c），3285 cm-1、1630 cm-1、1536 cm-1和1237 cm-1处的峰分别归因于N—H的伸缩振动、C=O（酰胺I）的伸缩振动、N—H（酰胺II）的弯曲振动，以及C—H的伸缩振动加上N—H（酰胺III）的弯曲振动，这表明在明胶中引入甲基丙烯酸酯时，酰胺键几乎未发生化学变化。由于甲基丙烯酸酯修饰，中心在3285 cm-1的峰在GM中变得尖锐。在明胶和GM的1H NMR光谱中（图1d），化学位移为δ = 7.0-7.4 ppm的信号归因于苯丙氨酸信号。由于甲基丙烯酸酯基团的丙烯酸质子，在化学位移为δ = 5.6和δ = 5.3 ppm处观察到两个新信号，赖氨酸亚甲基质子在δ = 2.8 ppm处的信号明显减弱，而GM在δ = 1.8 ppm处的甲基质子信号显著增强，这表明通过修饰明胶中的赖氨酸残基成功连接了甲基丙烯酸酯。根据公式计算出的取代度（DS）约为73.7%。

图1合成示意图以及ATR-FTIR光谱

【CMXG3-GM5水凝胶的流变学、形态学和物理化学性质】

CMXG（羧甲基黄原胶）和GM（明胶甲基丙烯酸酯）共同溶解在去离子水中，然后使用Irgacure 2959作为引发剂在紫外光（365纳米，30毫瓦/平方厘米）下照射，以获得光交联水凝胶（图2a）。当紫外光打开时，G'（储能模量）和G''（损耗模量）的值立即增加（图2b），而tanδ（损耗角正切）减小（图2c），并在60秒内趋于平稳，表明光交联反应的高效率。光交联水凝胶的G'和G''值随角频率的增加几乎不变（图2d），表明其具有类固体凝胶的行为。在线性粘弹性区域，光交联的CMXG3-GM5（3240±5帕）和CMXG5-GM5（2772±4帕）水凝胶的G'值低于XG3-GM5（11458±126帕）和XG5-GM5（18986±44帕）水凝胶（图2e），这是由于XG在羧甲基化过程中发生降解。然而，与XG3-GM5（40%）和XG5-GM5（28%）水凝胶相比，光交联的CMXG3-GM5（63%）和CMXG5-GM5（79%）水凝胶观察到更大的临界应变值，这表明由于前者中羧基含量更高，羧甲基化XG与GM之间存在更多的静电相互作用和氢键。

图2 合成示意图以及CMXG-GM5水凝胶的流变行为

光交联的CMXG3-GM5和CMXG5-GM5水凝胶被浸泡在含有150 mM NaCl的5 mM CaCl2和2.5 mM Na2HPO4的交替水溶液中，以进行仿生矿化。初始的（标记为第0天）和矿化后的CMXG3-GM5水凝胶（标记为第1天、第3天、第5天和第7天）的形态和物理化学性质通过SEM、XRD、ATR-FTIR和TGA进行了表征。从CMXG3-GM5水凝胶的横截面SEM观察来看，CMXG3-GM5水凝胶具有多孔结构，随着矿化时间的增加，矿化晶体逐渐在多孔间壁上形成（图3a）。从CMXG3-GM5水凝胶表面观察到，其表面覆盖着一层致密的膜结构和一个松散的网络，并且矿化后的CMXG3-GM5水凝胶表面上堆叠着矿化晶体（图3b）。对于矿化7天的CMXG5-GM5、XG3-GM5和XG5-GM5水凝胶，离散的晶体分散在多孔间壁上，而矿物沉积物覆盖在表面上。结果表明，离子扩散进入CMXG3-GM5水凝胶的间壁内并形成大部分均匀的晶体，但对于CMXG5-GM5、XG3-GM5和XG5-GM5水凝胶来说，矿化主要发生在表面上。

图3 扫描电镜图像、X射线衍射图谱和衰减全反射光谱

此外，矿化后的CMXG3-GM5水凝胶表现出比初始水凝胶更高的G'值（图4a），且G'值不随频率变化而变化（图4b），G'和G''曲线交点处的应变从14.5%增加到77.2%（图4c），这表明矿化后强度和韧性增加。将CMXG3-GM5水凝胶浸泡在盐水中后，其G'值略低于初始值，随着角频率的增加，观察到近似水平的线，G'和G''曲线交点处的应变重叠，这表明在盐水浸泡过程中机械性能没有显著损伤。矿化5天和7天后的CMXG5-GM5水凝胶表现出比初始水凝胶更高的G'值，但在盐水中浸泡的水凝胶G'值低于初始值（图4d-h）。CMXG5-GM5水凝胶在PBS中的溶胀比高于CMXG3-GM5水凝胶（图4i），导致前者结构更松散且G'值更低。CMXG3-GM5水凝胶在PBS和盐水中的溶胀比介于1.1到1.2之间，表明在这两种介质中具有相似的溶胀行为。

图4 矿化CMXG3-GM5的流变行为

【CMXG3-GM水凝胶的矿化条件优化及生物矿化研究】

本文设计了高GM（甘油甲基丙烯酸酯）含量的CMXG3-GM水凝胶，以提高机械性能并模拟天然骨骼中类胶原蛋白的含量。GM浓度分别为9、12和15 wt%的CMXG3-GM水凝胶，其水凝胶基质中GM的含量分别对应为75、80和83.3 wt%。由于粘度过高，难以与CMXG均匀混合，因此不易制备出GM浓度高于15 wt%的CMXG3-GM水凝胶。CMXG3-GM9、CMXG3-GM12和CMXG3-GM15的Zeta电位值分别为‒54.3±2.2、‒52.9±1.6和‒45.3±43.5 mV，这些值比CMXG3–GM5的Zeta电位值（x=‒64.1±3.2 mV）高一些，表明引入更高含量的GM导致负电荷略有减少。在紫外光照射（365 nm，30 mW/cm²）下直到100秒，这些水凝胶的储能模量（G'）和损耗模量（G''）值增加（图5a）。光交联水凝胶的G'和G''值表现出与角频率无关（图5b），并且在线性粘弹性区域，CMXG3-GM9、CMXG3-GM12和CMXG3-GM15水凝胶的G'值分别为27.7、37.8和51.5 kPa，而gc值分别为20.6%、22.8%和10.3%，这表明随着GM浓度从9 wt%增加到15 wt%，强度增加但延展性降低（图5c）。

图5 CMXG3-GM水凝胶的流变行为

然后，使用含有150 mM NaCl和0.01 M Tris缓冲液（pH = 8.94）的50 mM CaCl₂和25 mM Na₂HPO₄高浓度溶液作为矿化介质，以提高矿化效率。150 mM NaCl用于模拟生理环境，0.01 M Tris缓冲液用于调节矿化介质的pH值，以形成适合生成羟基磷灰石（HAP）的条件。由于足够的渗透压，离子可以被压入水凝胶中形成HAP矿物。pH值影响矿物晶体的生长速率和形态，特别是HAP的溶解度随pH值的降低而增加。因此，CMXG3-GM水凝胶在含有150 mM NaCl和0.01 M Tris缓冲液（pH = 8.94）的50 mM CaCl₂和25 mM Na₂HPO₄中进行生物矿化。最初，随着GM浓度从9 wt%增加到15 wt%，CMXG3-GM水凝胶呈现出从不透明的黄色到半透明的白色，然后在矿化后变为不透明（图6a）。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，矿化1天后，CMXG3-GM水凝胶表面覆盖了均匀且致密的矿物层，矿化7天后，球形矿物逐层萌发（图6b）。在CMXG3-GM水凝胶的X射线衍射（XRD）图谱中，矿化1天后在2q = 25.83、31.67、39.70和46.64°处出现了归属于结晶HAP的（002）、（211）、（310）和（222）晶面的衍射峰，矿化7天后在2q = 25.83、31.67、32.85、33.90、39.70、46.64和49.42°处出现了更尖锐、更完整的衍射峰，对应于结晶HAP的（002）、（211）、（112）、（202）、（310）、（222）和（213）晶面，表明晶体更加成熟且结晶度更高（图6c）。对于矿化7天的CMXG3-GM水凝胶，中心在20°附近的宽峰几乎消失。矿化1天和7天后，CMXG3-GM9、CMXG3-GM12和CMXG3-GM15水凝胶的结晶度分别计算为66.2%/85.2%、58.3%/77.4%和64.1%/72.1%。在矿化HAP的PO₄³⁻基团中，清楚地观察到了1020 cm⁻¹处的P-O（n3）峰和599及558 cm⁻¹处的O-P-O（n4）峰，并根据I₁₀₂₀/I₁₆₃₀的强度比，计算出矿化度分别为：矿化1天的CMXG3-GM9、CMXG3-GM12和CMXG3-GM15水凝胶为1.03、1.03和1.02，矿化7天的为3.32、2.35和2.31。

图6扫描电镜图像、X射线衍射图谱和衰减全反射光谱

【负载药物的CMXG/SXG3-GM12水凝胶的制备及仿生矿化】

硫酸软骨素是骨组织中糖胺聚糖的主要成分，由于其含有羧基和硫酸根，它有助于招募Ca2+离子、调节矿化并介导破骨细胞和成骨细胞的分化。黄原胶通过用氯磺酸进行化学修饰得到SXG（图7a）。CMXG和SXG一起被用于模拟硫酸软骨素在生物矿化中的复杂功能，同时也为CMXG/SXG基水凝胶提供可注射性。与XG的ATR光谱相比，SXG在1257 cm-1和811 cm-1处的新峰归因于硫酸根基团的不对称S=O伸缩振动和对称C-O-S伸缩振动（图7b），这表明硫酸化成功。

图7 SXG的合成示意图和傅里叶变换红外光谱

本文将水凝胶放置在交替的50 mM CaCl2和25 mM Na2HPO4水溶液中进行生物矿化，该溶液含有150 mM NaCl和0.01 M Tris缓冲液（pH = 8.94），从第1天到第7天，由于矿化沉淀的增加，水凝胶从透明变为半透明（图8a）。在7天矿化水凝胶的XRD图谱中，可以清晰地识别出与结晶HAP的（002）、（211）、（112）、（202）、（310）、（222）和（213）晶面相对应的尖锐峰，而1天矿化水凝胶的XRD图谱则出现了由于（002）、（211）、（310）和（222）晶面产生的相对较弱的峰（图8b）。对于1天矿化和7天矿化的CMXG3-GM12-CPFXH-LAP和CMXG/SXG3-GM12-CPFXH-LAP水凝胶，其结晶度分别计算为53.5%/78.9%和58.4%/77.3%。观察到了在1024 cm-1处的新峰对应于P-O（n3）以及在599和558 cm-1处的峰对应于PO43-基团中的O-P-O（n4），并根据I1024 / I1630强度比计算得出，1天矿化和7天矿化的CMXG3-GM12-CPFXH-LAP和CMXG/SXG3-GM12-CPFXH-LAP水凝胶的矿化度分别为1.18/2.42和1.30/2.41。在TGA曲线中，当温度从30℃编程升温到650℃时，矿化0天、1天和7天后，CMXG3-GM12-CPFXH-LAP的残余重量分别为30.0%、37.9%和50.5%，而CMXG/SXG3-GM12-CPFXH-LAP的残余重量分别为26.9%、38.6%和50.8%（图8c）。

图8 X射线衍射图谱、热重分析曲线和表面扫描电镜图像

【总结与展望】

本文通过光交联作用，由甲基丙烯酸明胶和羧化/硫酸化黄原胶衍生物制备了可注射、可矿化且载药的水凝胶。在黄原胶（XG）侧链中引入羧基和磺酸基，并采用适当浓度的离子和明胶（GM）以及合适的pH条件，有助于提高仿生矿化效率。与XG3-GM5和XG5-GM5相比，CMXG3-GM5和CMXG5-GM5表现出更负的zeta电位，这促进了前者在仿生体液中的矿化过程。虽然形成了结晶羟基磷灰石，但对于7天矿化的CMXG3-GM5水凝胶，其重量百分比仍保持在37%的较低水平，并且羟基磷灰石中共存有NaCl晶体。通过优化水凝胶基质的含量和矿化条件，以在功能和组成上更接近天然骨组织，进一步提高了模量和矿化程度。此外，7天矿化的载药CPFXH的CMXG/SXG-GM水凝胶显示出致密的矿物层，结晶度为77.3%，剩余重量百分比为50.8%，钙磷原子比为1.79，剪切模量为13.9 kPa。载药CPFXH的CMXG/SXG-GM水凝胶形成了有机-无机杂化复合材料，其化学成分与天然骨骼相似，以模拟骨传导性并以可控方式释放抗生素CPFXH药物。它也可以很容易地转移到模具中，并迅速光交联以形成具有各种图案高保真度的水凝胶构造。这种可注射、可矿化、生物相容且载药的CMXG/SXG-GM水凝胶可以为具有几何复杂空间的缺陷部位填充体积，并支持骨再生和修复所需的综合骨传导和抗菌功能。

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