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研究背景

Background

自然杀伤细胞（NK）和T细胞通过激活先天性和适应性免疫协同根除肿瘤。单抗疗法在临床试验中并未取得预期的结果，表明双/三特异性抗体是联合治疗的希望。目前，双/三特异性抗体已获批多项，但还未出现能够同时靶向NK和T细胞的三特异性抗体。

2024年7月，华南理工大学王钧教授团队在《Nature Communications》（IF=14.7）上发表了题为《Orchestrating NK and T cells via tri-specific nano-antibodies for synergistic antitumor immunity》的研究论文，构建出同时靶向NK和T细胞的三特异性抗体。

该抗体以抗-FC抗体共轭的白蛋白/聚酯复合纳米颗粒（APCN@NA）为纳米锚，固定了针对PD-L1（众所周知的检查点蛋白和肿瘤相关抗原）、NKG 2A（或TIGIT）（在激活的NK和T细胞中表达的NKG 2家族的抑制性成员）和4-1BB（在激活的NK和T细胞中表达的共刺激糖蛋白受体）的单克隆抗体，形成了三特异性纳米抗体 (Tri-NAb)。

Tri-NAb能够同时靶向PD-L1、4-1BB和NKG 2A（或TIGIT），有效激活NK和CD 8+ T细胞，促进它们的活化和增殖，从而诱导有效的肿瘤杀伤。

重要的是，已经在人源性肿瘤类器官和人源化小鼠等多种模型中验证了Tri-NAb的抗肿瘤功效，这表现出Tri-NAb共靶向的潜力。

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1、构建一种同时靶向PD-L1、4-1BB和NKG 2A的三特异性纳米抗体（Tri-NAb），并有效激活NK和CD 8+ T细胞。

2、使用改良的白蛋白/聚酯复合纳米颗粒（APCN）替代聚苯乙烯为纳米锚，解决了聚苯乙烯的安全性问题。

3、在不同小鼠肿瘤模型和人源化肿瘤类器官模型中，Tri-NAb都显示出良好的抗肿瘤效果，显示其临床应用的巨大潜力。

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一、Tri-NAb的制备与表征

采用单一乳化溶剂蒸发法制备APCNs，经过醛亚胺反应固定抗-FC抗体于APCNs表面，形成APCN@NA，再采用混合孵育法制备连接三种特异性抗，形成Tri-NAb，通过高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、荧光成像和电镜等对其成分和形态进行表征。

二、细胞实验

1、使用小鼠结肠癌细胞（MC38）、NK和CD8+ T细胞评估Tri-NAb的特异性结合能力。

2、通过流式细胞术和激光共聚焦探索Tri-NAb在MCS8、NK、CD8+ T细胞之间的相互作用。

3、使用细胞因子试剂盒验证Tri-NAb对NK和CD8+ T细胞下游信号的激活。

三、体内实验

1、使用C57BL/6小鼠构建MC38结肠癌模型，通过Cy5信号监测药代动力学过程和组织分布。

2、转录组学分析Tri-Nab对先天性和适应性免疫反应途径的改变。

3、使用C57BL/6小鼠构建B16-F10黑色素瘤模型，通过流式细胞仪评估Tri-Nab对荷瘤小鼠肿瘤微环境的改变。

4、构建人源化三特异性纳米抗体（Hu Tri-NAb），评估其对人源性结肠癌类器官模型的肿瘤杀伤能力。

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基因测序结果表明，用Tri-NAb治疗后，在涉及NK细胞介导的细胞毒、T细胞激活和T细胞增生信号途径的基因中，Tri-NAb治疗组中观察到的表达水平高于其他组。这表明，Tri-NAb通过激活NK和CD8+ T细胞介导的先天性和适应性免疫，有效得抑制了MC38结肠癌各个阶段的生长。

在小鼠黑色素瘤模型中，流式结果表明：静脉注射Tri-NAb成功地增强了肿瘤微环境的中NK和CD8+ T细胞的激活和增殖，即使在低剂量下，Tri-NAb仍然能够有效控制肿瘤进展。

肿瘤类器官有效地保留了肿瘤组织的生物学特征和同质性，使其成为肿瘤研究的典型模型。在人源性结肠癌类器官模型中，流式结果显示Hu Tri-NAb介导的类器官杀伤（CFSE+ PI+细胞）比例显着增加，表明Hu Tri-NAb在体外对人类肿瘤发挥了良好的细胞毒性作用。此外，在用人外周单核细胞（PBMCs）重建的免疫缺陷NCG-hIL15小鼠模型中，与单独使用Hu Tri-mAbs治疗相比，Hu Tri-NAb治疗有效抑制了HT-29人结肠癌细胞的生长。结果显示Hu Tri-Nab能增加肿瘤组织中NK和CD8+ T细胞的浸润，并显著提高人干扰素-γ（IFN-γ）、颗粒酶B和穿孔素的水平。这种对人类肿瘤的卓越抑制作用可能归因于先天性和适应性免疫反应的增强，表明了Hu Tri-NAb作为治疗人类肿瘤的治疗方法的潜在希望。

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目前的癌症免疫治疗策略主要集中在抗原特异性适应性免疫治疗，同时靶向NK和CD8+ T细胞的报道少见。该研究中构建了一种三特异性纳米抗体（Tri-NAb），靶向PD-L1/4-1BB/NKG 2A，以同时激活NK和CD8+ T细胞。重要的是，在多种肿瘤模型中，Tri-NAb的高亲和力增强了细胞的相互作用，增强了NK和CD8+ T细胞的颗粒酶B和穿孔素释放，能有效杀死肿瘤细胞。

总之，该研究构建的新型三特异性纳米抗体Tri-NAb具有可行性和有效性。根据治疗目的，还可灵活替换，使其适用于各种癌症或其他疾病，具有巨大的临床应用潜力。

参考文献

[1] Ye, QN., Zhu, L., Liang, J. et al. Orchestrating NK and T cells via tri-specific nano-antibodies for synergistic antitumor immunity. Nat Commun 15, 6211 (2024).

END

文案 | 木玲

排版 | 姜笑南

审核 | 姜笑南

发布｜姜笑南

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