北京2024年9月12日 /美通社/ -- 载体构建是蛋白表达等很多实验的起点，也许你知道可以通过优化启动子、调整表达载体、选择合适的宿主细胞、控制培养条件等来提高蛋白表达量，但你是否关注过密码子优化这个关键步骤呢？当遇到片段扩增失败，或载体难构建的情况，也许你会不停优化引物设计、或更换试剂，你是否知道可以通过序列优化增加载体构建成功率呢？
在理解密码子优化的重要性之前，需先了解密码子在基因表达中的作用。DNA序列通过转录和翻译产生蛋白质，而每个密码子由三个核苷酸组成，指定一个特定的氨基酸。这种对应关系在密码子表中明确列出，例如，密码子"ATG"编码甲硫氨酸（Met），开始蛋白质的合成。苯丙氨酸（Phe）对应的密码子有UUU和UUC，而终止密码子包括UAA、UAG和UGA。这种精确的编码方式确保了蛋白质合成的准确性和特异性。
图1.密码子表
虽然不同的密码子可编码相同的氨基酸，但不同生物体对密码子的使用存在偏好。这种偏好与每个生物体内特定tRNA的丰度相关。基因表达水平与密码子偏好性之间存在强相关性，同一氨基酸在不同宿主中，其对应的密码子会表现出不同程度的偏好[1]。因此，直接使用未优化的基因序列可能导致外源基因在宿主，特别是异源宿主中的表达效率低下。
密码子优化（codon optimization）是在不改变基因编码蛋白质的前提下，通过调整基因编码序列中的密码子使用频率，使用物种偏好密码子并避免稀有密码子得到优化序列，来提高外源基因在宿主细胞中表达水平的技术[2]。
对于自己构建载体的客户来说，是无法进行密码子优化的，因此采用基因合成方法来构建载体就成为了首选。
序列优化涉及更广泛的序列调整，包括优化GC含量、避免重复序列、消除不利的mRNA二级结构等，目的是提高整个基因的稳定性和表达效率，同时不改变最终编码的氨基酸序列。
优化原则（1）密码子偏好性
密码子适应指数CAI是指异源mRNA序列中密码子和宿主细胞最佳密码子使用频率相符合的程度，理论上此值越接近1，外源mRNA在宿主细胞中的蛋白表达越高，通常CAI＜0.8时，被认为需要进行密码子优化。使用宿主细胞中使用频率高的同义密码子替换外源mRNA序列中的密码子，例如，在大肠杆菌中，某些密码子如TAA和TAG可能很少使用，而GCA（编码丙氨酸）的使用频率较高。且避免出现稀有密码子，稀有密码子可能导致翻译停顿，增加翻译时的错误率，从而降低蛋白质产量。同时考虑高频和次高频的密码子组合。
注意CAI值过高可能导致外源基因在宿主细胞中过度表达，进而使得蛋白质在合成过程中积累过快，无法正确折叠，从而形成包涵体。包涵体是指在细胞内形成的不溶性蛋白质聚集物，通常是因为蛋白质未能正确折叠或是由于蛋白质表达水平过高。适当的密码子优化可以帮助调控蛋白质的表达速率，减少包涵体的形成，提高目标蛋白的正确折叠和可溶性表达。
（2）GC含量
理想的GC含量通常在40%-60%之间。过高的GC含量可能导致mRNA二级结构过于稳定，过低则可能影响转录效率。
（3）mRNA二级结构
复杂和稳定的二级结构会影响翻译效率，特别是序列中有和核糖体结合位点或翻译起始位点互作的序列，会阻止翻译的进行，合理优化翻译起始区的mRNA二级结构，可提高蛋白表达水平。
免费密码子及序列优化擎科生物独有的 GeneOptimizer 软件密码子优化算法是不仅局限于密码子层面的序列深度优化技术。支持上万种宿主优化和定制化服务。优化的主要参数包括：密码子偏好性、GC 含量、减少poly（A） 结构、重复序列、核糖体结合位点、酶切位点等。在保证密码子适应指数CAI和GC含量处在合理范围内，尽可能减少其他负面因素的影响，求得帕累托最优解，进而完成对基因表达的优化。擎科生物可为基因合成客户提供免费的密码子及序列优化服务。
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自动化方案设计擎科生物自主开发的自动化方案设计软件，根据载体和序列特点可批量设计多种高效构建方案，提高载体构建成功率。
案例分享：
（1）目标蛋白16.8 kDa，密码子优化前蛋白不表达，密码子优化后蛋白大量表达。
（2）目标蛋白100 kDa，密码子优化前包涵体表达，密码子优化后上清可溶表达75%。
[1] Sharp, P. M., & Li, W. H. (1987). "The Codon Adaptation Index—a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications." Nucleic Acids Research, 15(3), 1281-1295. [2] Gustafsson, C., Govindarajan, S., & Minshull, J. (2004). "Codon bias and heterologous protein expression." Trends in Biotechnology, 22(7), 346-353.
