百里香是中国山区广泛种植的一种落叶灌木以多糖(PMPs)为主要成分的百里香叶汁是中国传统果冻食品观音豆腐的原料，也曾被经验用于缓解炎症相关症状。

由于PMT叶多糖(PMPs)具有良好的凝胶性，PMT叶汁通常被用来制备果冻状的中国传统食品--观音豆腐。

在历史上，PMT叶也被用于治疗炎症相关症状，如肿胀、头痛、皮肤割伤、痢疾和感染，一些研究侧重于其精油、黄酮类和多酚的抗氧化和细胞毒活性。

然而，PMPs作为PMP叶和观音豆腐中的主要成分，其生物活性和化学结构特征尚不清楚。

饮食和肠道菌群被认为是慢性炎症的来源，导致慢性疾病，如心血管疾病、2型糖尿病和癌症，尤其是导致结直肠癌。

不健康的饮食模式，如高脂饮食，会通过肠道微生物群加重细菌内毒素脂多糖促进的肠道炎症，并刺激促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α、白介素1β和白介素6。

由于过量的ROS和脂质过氧化在脂多糖诱导的炎症中起关键作用，刺激内源性抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和过氧化氢酶(CAT)可以缓解炎症反应。

通过不同方法分别在酸性、中性和碱性条件下(HPMP、WPMP和APMP)提取和纯化PMP。测定了PMPs的单糖组成、平均相对分子质量、主链结构特征、表面微结构和晶相。

因此，我们还利用脂多糖刺激的RAW 264.7巨噬细胞模型研究了PMPs的体外抗炎和抗氧化活性。

百里酚多糖的提取：新鲜PMT叶采自安徽省小叶松种植基地中国，对小叶松鲜叶进行冷冻干燥和粉末化处理。

将50g冻干叶粉与1000mL去离子水混合成均匀的浊液，然后在500W、90℃的超声波辅助下加热1h，用0.5M的盐酸和氢氧化钠分别调节提取HPMP和APMP的pH值分别为1.5%和12%。

然后过滤和离心(3000g，15min)去除不溶成分，收集上清液，在4◦C下用95%乙醇沉淀过夜，用乙醇多次洗涤后，用塞瓦格法去除多糖沉淀中的蛋白质。

粗品用1型超纯水重新溶解，以0.1M、0.3M和0.5M氯化钠水溶液为流动相，DEAE-52柱层析纯化。苯酚-硫酸方法被用来监测洗脱。

收集主要峰部位，进行冷冻干燥，得到纯化的多糖组分，以供进一步研究。

百里酚多糖水解：PMP柱前衍生化法。10 mg的PMP在密闭的管内用2M的三氟乙酸在110◦C下水解6h。

然后，将该溶液在70℃下与纯甲醇共蒸馏3次，以去除多余的三氟乙酸。

400μL溶液用400μL 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液(0.5M)在70℃下衍生化2 h，用0.3M盐酸中和后加入1200μL氯仿3次除去剩余的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液。

采用Agilent1100系列色谱柱，二极管阵列检测器(DAD)。流动相为磷酸盐缓冲液(pH 6.6)-乙腈，流速为1.0m L/m in，柱温30℃。

图1.酸性(B)、中性(C)和碱性(D)条件下PMPs的提取(A)和纯化洗脱图谱。

氧自由基吸收能力测定：所有试剂和样品均在75 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中溶解。在96孔板中，将75μ的FL L(0.06μM)加入到每个多糖样品的25μL中。

培养板在37℃下孵育10分钟，然后加入AAPH(100μL，38 mm)。激发波长为485 nm，发射波长为538 nm，温度为37℃，每隔2分钟记录一次荧光，共120min。

用标准曲线表示ORAC值，以每克多糖干重的μ当量(TE)表示，该标准曲线是用Trolox溶液(6.25、10、12.5、25、50、75和100μM)建立的。

DPPH自由基清除：将不同浓度的PMP 2.0mL与新鲜配制的0.1mM DPPH乙醇溶液2.0mL混合。在25℃的黑暗中反应30min后，在517 nm处测量吸光度。

ABTS自由基清除：将不同浓度的PMP1.0mL与ABTS溶液4.0mL混合。在25℃下反应6min后，在734 nm处测定吸光度。

OH自由基：将2mL不同浓度的PMP分别加入1.5 mM的FeSO4溶液、3%的过氧化氢溶液和20 mM的水杨酸溶液中。将混合物摇动，在37摄氏度下孵化30分钟。在734 nm处测定吸光度。

RAW 264.7巨噬细胞在37◦C的RPMI1640X中培养。

人永生角质形成细胞系(HaCaT)细胞在含5%(v/v)CO2的湿空气中培养。将RAW 264.7巨噬细胞分别用溶媒或不同浓度(50~200μg/mLAPMP)处理1h。

然后，将细胞暴露于脂多糖(1μg/m L)中24 h，直到进一步分析。用倒置荧光显微镜观察RAW 264.7和HaCaT的细胞形态。用CCK-8比色法检测HaCaT的细胞活性。

简而言之，将CCK-8工作液在37℃下孵育4h，然后在450nm处用微板分光光度计测定吸光度。对照组CCK-8的光密度为100%活性。在每个浓度下进行一式三份的检测。

胞内ROS测定：DCFH-DA评估RAW264.7细胞内ROS的产生。简而言之，RAW264.7细胞在6孔板中以1×104个/孔的速度培养。

然后，用10μM DCFH-DA孵育20min，用PBS液清洗3次。使用倒置荧光显微镜和数码相机观察DCF的荧光。

用发射波长为530 nm的荧光计测量了在502 nm处激发的每个孔的荧光特性。

丙二醛和细胞内抗氧化酶活性的测定：采用丙二醛-硫代巴比妥酸加合物检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)检测RAW-264.7细胞丙二醛水平，并在535 nm波长处测定每孔的光密度。

超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)按试剂盒说明书进行超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性测定。

分别在535nm、520 nm和340 nm波长处用微板分光光度计法测定超氧化物歧化酶、过氧化氢酶(CAT)和谷氨酸脱氢酶(NADH)的含量。

用中国南京建成生物工程研究所BCA蛋白质浓度分析试剂盒测定各样品的蛋白质含量。

FTIR: 从小叶百日草叶片中分离得到HPMP、WPMP和APMP，得率分别为6.68%、7.65%和18.54%。

3500 cm−1代表O-H振动和2950 cm−1来自C-H伸缩振动附近，显示出典型的多糖FT-IR光谱特征。每个样品在1640 cm−1和1740 cm−1附近的FT-IR谱峰归属于游离和酯化羧基的C-O伸缩振动，表明存在葡萄糖醛酸结构。

在1010厘米−1到1150厘米−1之间的吸收峰表明PMPS样品中含有吡喃糖。

此外，根据1740 cm−1/1740+1630 cm−1峰面积的比值，估算出高、低甲氧基果胶的酯化度(DE)分别约为35%和53%，说明WPMP属于高甲氧基果胶，而HPMP属于低甲氧基果胶。

在APMP光谱中，1740 cm−1附近的峰消失，表明APMP中含有少量的酯化羧基。

图2.HPMP(B)、WPMP(C)和APMP(D)的FT-IR光谱(A)和1H核磁共振分析

1HNMR分析：最明显的峰位于δH4.7处，归因于溶剂信号(D2O)。

化学位移在4.0ppm-5.0ppm和5.0ppm-5.6ppm代表β-糖苷和在每个PMPS的1H核磁共振谱中分别观察到α-糖苷构型，以及3.69ppm的信号，该信号来自与Gala的羧基结合的甲基。

5.02/4.97ppm的峰代表了PMPs中α-半乳糖醛酸质子H-1的异常。此外，3.54、3.93、4.08/4.10和4.34/4.88ppm的信号分别归因于α-半乳糖醛酸的H-2、H-3、H-3和H-5。

4.34ppm对应于非酯化GALA的H-5，4.88ppm对应于酯化半乳糖醛酸。5.29ppm的信号归因于α-Lara的反常质子。

在APMP光谱中，1.17ppm和1.39ppm的信号分别来自O-2和O-2，4连接鼠李糖的甲氧基，这与单糖组成分析相一致。

单糖组成和Mw: 提取pH显著影响PMPs的化学和结构特征。

HPMP主要由GALA、GLC和GUL组成，分别占总单糖的67.04%、16.38%和4.29%，GALA、GLC、Gal、MANA和GULA分别占66.27%、16.98%、3.92%，分别占WPAP总单糖的2.91%和2.83%。

值得注意的是，APMP主要由GLC、GALA和GAL组成，分别占单糖总量的37.6%、28.3%和12.2%，其次是Ara(6.8%)和Rha(6.44%)。

APMP的GALA水平低于HPMP和WPMP，但GLC、Gal和Rha等中性糖水平要高得多(图3a-c)。

图3.Mw、单糖组成成分分析

这一结果与之前的报道一致，即碱性条件会导致HG结构域的降解和与半纤维素密切相关的果胶的释放。

HPMP、WPMP和APMP的每个样品都有两个主峰，平均重量分别为213 kDa、238 kDa和289 kDa(图3d-f)。

HPMP、WPMP和APMP的多分散指数(PDI)分别为1.11、1.71和2.66，表明APMP可能是一种相对分子质量分布较宽的均相多糖。

HPMP、WPMP和APMP的X射线衍射谱不同，包含不同的弱衍射峰(图4A)。

HPMP在13◦和32◦，APMP在12◦和19◦处有非常细小而尖锐的峰，而WPMP在X射线衍射图上没有尖锐的峰。

由于结晶材料的衍射峰很窄，而非晶组分的衍射峰很宽，所以所有的PMPS样品都可能是以非晶组分为主，含有少量的微晶结构。

HPMP粉末呈光滑的簇状，表面附着有小的球形粒子(图4B)，WPWP粉末呈多层条状，折叠较多(图4C)，而APMP粉末呈较小粒子，表面结构粗糙疏松(图4D)。

生物聚合物的颗粒大小和表面结构特征会对其物理化学性质产生重要影响，如溶胀性、保水性、溶解性和胶凝性等。

这一发现表明，APMP比HPMP和APMP具有更好的水溶性和更高的溶解速度可能部分源于其表面结构特性。

图4.HPMP(B)、WPMP(C)和APMP(D)的X射线衍射图(A)和扫描电子显微镜图像。

三种PMPs的荧光衰减曲线均高于空白对照，且曲线下的净面积和荧光强度与PMPs浓度呈良好的线性关系(图5a-d)。

HPMP、WPMP和APMP的ORAC值分别为246.4、101.5和415.5μmolTrolox/g，表明APMP的抗氧化活性明显强于HPMP和HPMP。

APMP的ORAC值甚至高于竹笋多糖(101.5-197.8μmolTrolox/g)和海带多糖。测定HPMP、WPMP和APMP的DPPH、ABTS和羟基自由基清除能力及总还原能力。

在实验浓度范围内，三种PMP均表现出显著的清除DPPH自由基的活性，且其活性与其浓度呈正相关(图5e)。

4 mg/mLHPMP、WPMP和APMP对DPPH自由基的清除率分别为92.9%、86.8%和95.6%，相当于0.89 mg/mL0.36 mg/mL1.61 mg/mLDPPH-抗坏血酸(图5e)。

PMPs表现出较高的DPPH自由基清除活性。

PMP的半数抑制浓度在0.058 mg/m L时最低(p<0.0 5)，当浓度大于1 mg/m L时，其清除DPPH自由基的能力接近Vc。

PMPs在浓度高于1 mg/mL时也表现出明显的ABTS自由基清除作用，且其清除能力随浓度的增加而增强(图5F)。

HPMP、WPMP和APMP的ABTS自由基清除率在1 mg/mL时分别达到39.6%、55.7%和76.1%，在4 mg/mL时分别上升到84.1%、81.9%和94.1%，与3.10 mg/mLVc非常接近。

APMP还表现出最强的ABTS自由基清除作用。

HPMP、WPMP和APMP对羟基自由基有不同的清除能力，但也表现出浓度依赖的清除能力(图5G)。

HPMP、WPMP和APMP的IC50值分别为4.178、1.894和1.013 mg/mL，其IC50值的大小顺序为HPMP<WPMP<APMP(表S1)。

APMP具有比HPMP和WPMP更强的清除羟基自由基活性，4 mg/mLAPMP对羟基自由基的清除率为81.7，相当于0.75 mg/mLVc。

图5.无细胞体系中PMPs的抗氧化活性。ORAC试验(a-d)和DPPH(E)、ABTS(F)和羟基自由基(G)的清除活性。

在10~500μg/mL浓度范围内，APMP对RAW 264.7巨噬细胞无明显的细胞毒性作用。用氧化敏感探针DCFH-DA检测RAW 264.7细胞中ROS的表达。

荧光显微镜图像和荧光强度测量表明，50μg/mL及以上浓度的APMP预处理细胞可剂量依赖性地抑制ROS的产生。

激活抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷丙转氨酶，可以通过抑制氧自由基、羟基自由基和氧化应激来减少内毒素和其他不同应激源引起的细胞损伤。

并通过抑制氧自由基、羟基自由基和氧化应激，恢复与RAW 246.7巨噬细胞对照水平的细胞状态(Park等，2011年)。

结果表明，与模型组和正常组相比，APMP预处理组大鼠血清中的SOD、CAT和GPX酶活性均呈浓度依赖性升高，而内毒素诱导的上述酶活性均显著降低(P<0.05)。

正常组超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷丙转氨酶活性分别为112.3、26.8和122.7 U/mg，模型组分别降至75.6U/mg、26.8和57.8U/mg(图6d-f)。

APMP能有效地激活超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和GPX的活性。

50μg/mLAPMP和100μg/mLAPMP分别上调脂多糖刺激的RAW 246.7巨噬细胞超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，与正常组和阳性组相当(图6d，e)。

200μg/mLAPMP使GPX的酶活性恢复到与正常巨噬细胞相当的水平。

图6

图6为APMP对脂多糖刺激和未刺激的RAW 264.7巨噬细胞ROS(a和b)、丙二醛(C)、超氧化物歧化酶(D)、过氧化氢酶(E)和谷丙转氨酶(F)、肿瘤坏死因子-α(G)、IL-1β(H)和IL-6(I)的影响。

【1】百里酚多糖的结构特征、理化性质及抗氧化活性

【2】饮食结构分析和低度炎症的生物标记物：系统的文献综述

【3】竹笋残渣多糖的理化性质和抗氧化活性的表征：干燥过程的影响。