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都知道菜籽粕、棉籽粕不能直接用，但是用哪种菌发酵效果更好没有一个人说的清！
今天水产研究社通过查阅资料来为大家带来一个准确的，有实验依据的答案和方法。
首先说下菜籽粕：
菜籽粕是我国第二大蛋白质原料, 其营养物质丰富, 氨基酸组成全面, 富含含硫氨基酸、蛋氨酸和半胱氨酸等氨基酸及硒、镁、铁、钙等矿物质。
欧盟、中国、加拿大和印度是全球四大菜籽粕生产国/组织, 2020年我国菜籽粕产量达到909万吨,居于世界第二位。
随着水产养殖规模的不断增加, 水产行业饲料供给不足, 而菜籽粕可作为潜在的新型植物蛋白源应用于水产饲料行业。
但是菜籽粕含有的高碳水化合物、高粗纤维及大量抗营养因子成为其在水产饲料中的限制因素。
抗营养因子过量会导致动物消化功能、抗氧化能力与免疫功能受损, 并且会降低摄食量和生产性能。
有研究已表明, 菜籽粕经过发酵可以有效降解硫甙、单宁和植酸等抗营养因子, 并通过水解蛋白质为易吸收小分子多肽等来提高菜籽粕的营养价值 。
因此, 发酵菜籽粕可作为一种有潜力的饲用蛋白源应用于水产饲料行业。发酵菜籽粕在畜禽生产中的研究较广泛, 已证明它可以提高动物增重率、生产性能和免疫力, 增加动物对饲料的表观消化率, 增加矿物质利用率并改善肠道健康。
接下来说下棉籽粕：
棉籽粕(Cottonseed meal, CSM)是水产饲料中替代鱼粉的重要蛋白源之一[1] , 具有产量稳定、蛋白质含量高、氨基酸组成较为平衡等优点。
然而,棉籽粕中高水平的游离棉酚(Free gossypol, FG)限制了其在饲料行业的应用。
游离棉酚会影响生物机体内酶的功能, 改变细胞膜的通透性, 并且会影响生物机体对矿物质元素和蛋白质的消化吸收 ,一旦摄入量过大, 会对生物体产生不可逆的伤害。
此外, 还存在如植酸、单宁等抗营养因子, 同样会对生物体的营养利用及健康造成损害。
目前已经开发了多种方法来降解棉籽粕中的游离棉酚, 例如使用有机溶剂, 如丙酮和乙醇, 可以从棉籽粕中提取游离棉酚, 从而减少游离棉酚含量。
然而, 此方法会造成棉籽粕中蛋白质溶失, 降低蛋白质质量。此外, 促使游离棉酚与其他化合物的结合也是有效方法, 如FeSO4或Ca(OH)2 , 然而, 用FeSO4等化合物结合游离棉酚会导致饲料颜色及其他性状的变化, 并且会降低棉籽粕的适口性和营养物质的含量。
发酵技术
固态发酵被认为是降解棉籽粕中游离棉酚及其他抗营养因子含量的最有效方法之一。
此外,发酵过程中的代谢活动可能会产生一些酶、维生素和一些其他未知的有益物质, 提高棉籽粕的营养价值, 这些物质往往会对机体的生长和健康产生有利效果, 从而扩大了棉籽粕在水产养殖业中的应用。
芽孢杆菌可以有效降解游离棉酚, 然而一些芽孢杆菌在氨基酸代谢过程中会发生脱羧基或脱氨基作用, 产生刺激性的氨, 影响发酵的风味, 而乳酸菌和酵母菌在厌氧发酵过程中会产生有机酸、醇类物质等, 能够提升棉籽粕的品质及风味。
基于此, 本研究首先以抗营养因子降解能力为指标, 筛选出降解能力强的枯草芽孢杆菌, 并使用单因素试验法对其发酵条件进行优化,随后在此优化结果基础上, 采用枯草芽孢杆菌配合酿酒酵母、植物乳杆菌, 并且加入纤维素酶、植酸酶辅助发酵棉籽粕, 对混菌发酵的菌液接种比例及酶添加量进行优化, 随后对其发酵效果进行评价。
试验结果
1 发酵条件对枯草芽孢杆菌发酵效果的影响
由图 1可知, 当使用枯草芽孢杆菌对棉籽粕进行单菌发酵时, 其接种量为11%时, 游离棉酚、植酸及单宁的降解效果均高于其他组。
由图 2可知, 当使用枯草芽孢杆菌对棉籽粕进行单菌发酵时, 当蒸馏水添加量和底物比例为0.8﹕1时, 对游离棉酚的降解效果均高于其他组, 而当比例为0.6﹕1时, 对棉籽粕中单宁和植酸的降解效果均高于其他组。
由图 3可知, 当使用枯草芽孢杆菌对棉籽粕进行单菌发酵60h之后, 游离棉酚、植酸及单宁的降解效果均显著高于前三组而与后一组无显著性差异。
1.2 混菌比例对固态发酵效果影响
如图 4所示, 当枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌的接种比例为1﹕1﹕2时, 固态发酵棉籽粕的植酸和单宁含量均低于其他组, 而总酸含量均高于其他组。
综合考虑, 枯草芽孢杆菌、酿酒酵母及植物乳杆菌的比例选取1﹕1﹕2时发酵效果较好, 此时, 棉籽粕的抗营养因子得到有效降解, 总酸含量得到显著提高。
1.3 纤维素酶添加比例对混菌发酵棉籽粕抗营养因子含量影响
由图 5可知, 纤维素酶添加对混菌固态发酵棉籽粕的植酸及单宁含量没有影响, 而能够进一步显著降低游离棉酚含量, 且当纤维素酶添加比例为1.25%时, 游离棉酚含量显著低于前三组而与第五组没有显著差异。
1.4 植酸酶添加比例对混菌发酵棉籽粕抗营养因子含量影响
由图 6可知, 植酸酶添加对混菌固态发酵棉籽粕的单宁含量没有影响, 而能够进一步显著降低游离棉酚和植酸含量。且当植酸酶添加比例为0.03%时, 游离棉酚含量显著低于前两组而与后两组无显著性差异, 添加比例为0.1%时, 植酸含量显著低于前三组而与后一组无显著性差异。
1.5 混菌发酵感官评测
由表 1可知使用混菌发酵后, 棉籽粕的质地和气味都有改善, 并且在感官评价上要优于枯草芽孢杆菌单菌发酵。
1.6 混菌发酵后棉籽粕中抗营养物质、粗蛋白、酸溶蛋白、总酸含量测定
由表 2可知, 发酵后棉籽粕中的抗营养物质显著降低, 其中游离棉酚降解率达到40.13%, 植酸降解率达到34.92%, 单宁降解率达到40.24。此外, 粗蛋白, 酸溶蛋白, 总酸含量显著上升, 分别提高了10.26%、59.20%和79.49%。
讨论
枯草芽孢杆菌是美国食品药品管理局认证的无害菌种, 是目前工业生产中使用最普遍的一种菌 。
有研究人员对一株产植酸酶枯草芽孢杆菌发酵棉籽粕的工艺进行优化, 结果表明最佳发酵条件: 温度37℃, 时间周期72h, 底物初水分30%, 初始pH 7.0, 接种量为7%。
Zhang等通过单因素试验获得枯草芽孢杆菌对棉籽粕的最佳发酵条件为: 发酵时间72h, 发酵温度39℃, 初始pH 6.5, 初始含水量50%, 接种量1.0×10的7次方 CFU/g。
对一株高效降解棉酚的芽孢杆菌诱变菌株进行参数优化发现: 物料含水量控制在45%—50%, 菌剂使用量为1.0×10的10次方 CFU/kg, 发酵时间13—15天为最佳发酵条件。
而在本研究中通过单因素实验确定枯草芽孢杆菌单菌发酵最佳条件为接种量为11%, 最佳水料比为(0.6—0.8:1), 最佳发酵时间60小时, 不同种的枯草芽孢杆菌的最佳发酵条件不同, 这种差异可能是由物种本身的生物多样性造成, 也有可能是因为底料的差异所导致。
感官性状是评价棉籽粕应用效果的最直接指标。我们在使用枯草芽孢杆菌单菌发酵过程中发现, 发酵之后棉籽粕常常结块严重, 在烘干之后, 硬度增加, 不利于粉碎, 并且散发出刺鼻的酸腐味, 这些性状的变化都不利于发酵棉籽粕的应用, 并且其对植酸的降解效果不理想。有研究人员利用多种酵母菌分别对棉籽粕进行发酵, 发现其发酵产物均具有酒香味。
此外, 许多研究者发现, 采用酵母菌、乳酸菌和芽孢杆菌进行复合发酵, 能够有效的改善棉籽粕的感官性状, 提升其风味 , 并且乳酸菌发酵还有提升饲料适口性及消化率等功效。
因此, 我们使用酿酒酵母、植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌混合, 并在物料中初始添加植酸酶及纤维素酶溶液, 随后采用好氧-厌氧分步发酵棉籽粕, 发现混菌发酵相比于单菌发酵显著提升了棉籽粕的感官评价指标。
这可能是因为酵母菌和乳酸菌在厌氧发酵过程中产生了醇类物质及有机酸等 , 提升了发酵棉籽粕的风味。此外, 还发现植酸降解效果的提升, 说明发酵前添加植酸酶溶液, 酶的水解作用与微生物发酵过程能够协同进行。
在发酵植物原料的实际操作过程中, 微生物自身产生的酶可能量不足或者活性不够, 因此在对某些大分子物质的水解过程当中并不能产生很好的效果。
而单独的酶解过程并不能产生有益的微生物代谢物, 如柠檬酸、草酸和乳酸可分别由黑曲霉、米曲霉和乳酸杆菌分泌。
因此菌酶协同发酵结合了单独微生物发酵或酶解发酵的优点, 不仅能显著分解植物原料中的大分子物质, 而且能得到有机酸等有益的微生物代谢产物, 具有很高的实际生产价值。
由于单胃动物消化系统中没有粗纤维降解相关酶, 过量粗纤维不仅会增加动物饱腹感,降低摄食量, 还会降低饲料转化率。
棉籽粕中含有大量的粗纤维, 添加纤维素酶通过破坏植物细胞壁降解棉籽粕中的粗纤维, 可以增加棉籽粕的利用率。
本研究发现, 添加纤维素酶能进一步降低混菌发酵棉籽粕中游离棉酚的含量, 可能原因是其对粗纤维的降解提升了微生物对棉籽粕中碳水化合物的利用率从而促进其生长代谢。
植酸能和金属阳离子或蛋白质发生螯合作用, 从而降低矿物质的生物效能, 影响水解酶的活性, 降低蛋白质的利用率并影响动物的消化吸收功能。
在单独微生物发酵中, 我们发现植酸的降解效率不高, 因此在发酵底物中添加植酸酶。
酶制剂可以促进饲料中营养成分的分解和吸收，提高其利用率，多由微生物发酵或从植物中提取，按所含酶类可分为单一酶和复合酶。
酶（enzyme）是一类由活细胞（这些活细胞可以是细菌也可以是真菌，比如我们常用的芽孢杆菌，乳酸菌以及酵母菌都可以产生酶）产生的，对其特异 底物（这个底物在水产养殖中针对的就是我们平时投喂的饵料）具有高效催化作用的蛋白质或RNA。不改变反应的平衡，只是通过降低活化能来加快反应的速度。
酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的 生物催化剂。
结果表明植酸酶能显著降低棉籽粕中的植酸含量, 并进一步提升对游离棉酚的降解效果, 说明植酸酶的水解作用能够与微生物的发酵过程协同进行, 在有效水解植酸的同时能进一步提升微生物的繁殖及代谢活动。
随后我们分析了混菌发酵的抗营养因子降解率以及粗蛋白、酸溶蛋白、总酸含量。
发现游离棉酚、植酸和单宁的降解率分别达到了40.13%、34.92%和40.24%, 粗蛋白、酸溶蛋白和总酸含量分别提升了10.26%、59.2%和79.49%。
其中, 酸溶蛋白是反映发酵底物中小肽和游离氨基酸含量的重要指标 , 而发酵过程中乳酸菌产生的乳酸等有机酸, 通常能起到抑制有害微生物生长、促进有益微生物生长的作用。
宣秋希等用酿酒酵母、植物乳杆菌、芽孢杆菌进行厌氧-好氧分步发酵, 结果表明, 游离棉酚降解了66.28%、粗蛋白提升了6.38%、酸溶蛋白提升了88.30、L-乳酸的含量从0.01提升到了1.83 g/L。
亓秀晔等用植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌进行好氧-厌氧分步发酵棉籽粕,显著降低了棉籽粕游离棉酚含量、显著提升了酸溶蛋白含量。
此外, 罗远琴等使用枯草芽孢杆菌和酿酒酵母对棉籽粕进行混菌发酵, 显著提升了棉籽粕的酸溶蛋白及棉籽肽含量, 以上这些研究结果都与本研究得到类似的结果。
综上, 使用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母及植物乳杆菌混菌发酵不仅能有效降解棉籽粕中的抗营养因子含量, 同时能提高其营养价值。
并且相比于枯草芽孢杆菌单菌发酵, 配合酿酒酵母以及植物乳杆菌能提升发酵棉籽粕的感官指标及其风味, 此外, 在底物中添加外源性纤维素酶以及植酸酶能进一步提升发酵效果, 从而提升其应用价值。
结论
本研究探究了枯草芽孢杆菌单菌发酵棉籽粕降解抗营养物质含量的最佳条件, 同时测评了枯草芽孢杆菌配合酿酒酵母、植物乳杆菌及添加纤维素酶及植酸酶溶液进行混菌发酵的效果。
结果表明, 混菌加酶发酵能有效降低棉籽粕抗营养因子含量, 提升营养价值, 并提升其风味, 从而提升其应用价值, 为生产实际提供了一定的理论基础。
