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由来自澳门科技大学的XingXia Wang，Wei Hu，LiQun Qu以及Betty Yuen Kwan Law等多名研究人员在期刊Pharmacol Res上，共同发表了题为“Tricin promoted ATG-7 dependent autophagic degradation of α-synuclein and dopamine release for improving cognitive and motor deficits in Parkinson's disease”的文章，在该文章中，研究人员使用了购自AbMole的Tricin（苜蓿素，M5206），揭示了Tricin通过AMPK-p70s6K和ATG7依赖机制诱导自噬降解和多巴胺释放，从而改善认知和运动障碍的新机制。
研究人员首先通过荧光测量和流式细胞仪分析，证实Tricin能增强自噬作用（图1A），提高 PC12 细胞中 LC3-II 的水平（图1B）。并发现自噬体形成抑制剂能阻断Tricin处理的细胞中蛋白质向 LC3-II 的转化（图1C-D），提示Tricin能在细胞水平诱导自噬。
图 1 (A) 在 PC12 细胞中使用自噬检测试剂盒进行 MDC 染色。阳性对照（Rapamycin，400 nM）和Tricin（20-80 μM）给药 24 小时，流式细胞仪对 MDC 的荧光信号进行定量。(B) 给 PC12 细胞注射Tricin（20-80 μM）24 小时，并通过免疫印迹（WB）分析 LC3-II 的蛋白表达。(C）Wortmannin对Tricin处理细胞中 LC3-II 转化的影响。PC12 细胞用 DMSO 或 60 μM 的Tricin处理 24 小时，同时添加或不添加 1 μM的Wortmannin。(D) PC12 细胞在有或没有Bafilomycin A1（Baf A1，50 nM）的情况下用 DMSO 或 60 μM 的Tricin处理 24 小时。
随后，研究人员利用转染mRFP-GFP-LC3的U87细胞和秀丽隐杆线虫模型（2A-B）进一步确定了 Tricin的自噬诱导效应。通过将Tricin与 PC-12 细胞孵育，并使用Western 印迹检测 p-AMPK/AMPK 和 p-P70s6K/p70s6K 的蛋白表达。证实Tricin能通过 AMPK-p70s6K 依赖性信号通路诱导自噬。
图 2 (A) U87-mRFP-GFP-LC3 稳转细胞经 20-60 μM 的Tricin处理 24 小时。图中显示了 3 个独立实验中每组细胞中 mRFP-LC3 点的合并定量。(B) 用 elegans 模型 DA2123（LGG-1::GFP）和模型 BC12921（SQST-1/p62::GFP）通过荧光分析 GFP 标记的目标蛋白来评估Tricin的自噬活性。Rapamycin（20 μM）作为阳性对照。
此外，通过使用RT-PCR 阵列对自噬相关基因进行分析（图 3A- B），并进行进一步的 STRING 分析预测，发现 Tricin能提高一系列自噬基因的水平，并可通过 ATG7 依赖性机制诱导自噬。
图 3 (A) PCR 阵列结果的散点图。(B) 表格显示 mRNA 水平发生显著变化（> 1.5 倍）的自噬基因。
随后，研究人员使用试剂盒测定经Tricin处理后 SH-SY5Y 细胞中 α-syn 的水平（图 4A），并在 Schrodinger 中进行Tricin与α-syn 的对接模拟（图 4B），发现Tricin能和 α-syn 直接结合，并具有良好的结合亲和力，Kd 值为 13.76 μM（图 4C）。此外，通过进一步研究证实了Tricin能通过ATG7 依赖的自噬作用降低突变体 α-syn 的水平。
图 4 (A) 在SH-SY5Y细胞中，施用Tricin（0-100 μM）24小时后，使用人α-syn ELISA试剂盒。并通过酶标仪定量荧光强度。(B) 分子对接显示Tricin与 α-syn 的结合倾向。 (C) 生物层干涉测量法（BLI）显示Tricin与 α-syn 的结合倾向（Kd 值）。
接下来，研究人员构建 A53T-α-syn 转基因PD小鼠模型（图5），并通过行为学实验证实Tricin能改善PD小鼠的运动，记忆以及认知能力。随后组织学实验（H&E 及Nissl染色）结果说明Tricin能够改善 PD 转基因小鼠的组织病理学情况。
图 5 动物实验时间图。
最后，通过ELISA，UPLC-MS以及Western 印迹法等多种方法进一步研究发现，在Tricin给药组的血清和脑样本中 DA 含量升高（图6A-B），血清中的炎性细胞因子水平显著下降（图6C），表明Tricin能减轻PD小鼠的炎症反应。此外，Tricin处理组小鼠纹状体中TH蛋白的表达量明显增加（6D），表明Tricin能通过上调酪氨酸羟化酶（TH）来提高PD小鼠的DA水平，从而发挥其神经保护作用。
图 6 Tricin能提高A53T转基因PD小鼠多巴胺和自噬标记物的水平，并可降低炎性细胞因子和 α-syn的水平。(A）用小鼠多巴胺（DA）ELISA试剂盒评估各组小鼠的血清多巴胺水平。(B) 用 UPLC-MS 分析小鼠大脑中的多巴胺水平。 (C) 按指示进行酶联免疫吸附试验检测炎症标记物。流式细胞术用于检测各组小鼠血清中炎症因子的表达。(D) 通过 Western 印迹分析各组小鼠纹状体中 LC3-Ⅱ、TH和 α-syn 的蛋白水平。条形图表示 LC3-Ⅱ、TH 和 α-syn 水平与 β-actin 的归一化。
研究人员在该研究中多次使用了购自AbMole的Tricin（苜蓿素，M5206），该产品是一种天然无毒的黄酮类化合物，可清除自由基，并具有抗炎和抗氧化活性。
研究人员将不同浓度的Tricin与 PC-12 细胞孵育，并通过 Western 印迹检测 p-AMPK/AMPK 和 p-P70s6K/p70s6K 的蛋白表达。结果显示，Tricin能以剂量依赖的方式显著降低 mTOR 底物 p70s6K 的磷酸化形式，而不改变总 p70s6K 的水平（图7A）。此外，它还增加了 p-AMPK 的表达，而不改变 AMPK 总形式的表达。为了进一步确认Tricin是否通过 AMPK-p70s6K 信号通路诱导自噬，研究人员在Tricin存在的情况下加入了 AMPK 抑制剂（compound C）（图 7B- C） ，发现虽然Tricin增加了细胞中 LC3-II、p-AMPK 和 GFP-LC3 点的表达水平，但compound C 的存在能抑制这些作用，证实Tricin能通过 AMPK-p70s6K 依赖性信号通路诱导自噬。
图 7 Tricin能激活AMPK-p70s6K 信号通路。(A) PC12 细胞经Tricin（0-80 μM）处理。然后收获细胞裂解液，分析 p-AMPK、总 AMPK、p-P70s6K 和总 p70s6K。磷酸化形式的 AMPK 和 p70s6K 的条带强度通过与相应的总形式进行归一化来量化。(B) PC12 细胞经 60 μM 的Tricin和 5 μM 的compound C（CC）处理 24 小时。条形图表示 LC3-II 与 β-actin和 p-AMPK 与总 AMPK 水平的归一化。(C）U87-GFP-LC3 稳转细胞用Tricin（60 μM）处理，同时添加或不添加 CC。然后用荧光显微镜分析细胞。
此外，H&E 染色显示，模型组的锥体细胞杂乱无章，有坏死细胞。而Tricin处理组（40 mg/kg和60 mg/kg）和左旋多巴组在CA1区和皮质区细胞的坏死细胞更少。在 WT 组中，Nissl 染色显示 CA1区和皮质区有清晰的胞浆染色和丰富的 Nissl 体。与 WT 组相比，模型组的 CA1 和皮质区显示出 Nissl 体的缺失。相比之下，Tricin处理组的锥体细胞胞浆中有更多的Nissl 体染色，表明Tricin能够改善 PD 转基因小鼠的病理学状态。
综上所述，类黄酮Tricin能通过AMPK-p70S6K和ATG7依赖途径增强自噬作用，加速α-syn降解，改善转基因小鼠的行为、学习和记忆能力，减少炎症细胞因子的过度释放，该实验对认知和运动障碍的进一步研究具有重要意义。
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鸣谢：Wang X, Hu W, Qu L, et al. Pharmacol Res. 2023 Oct;196:106874.
