文献：Journal of Medicinal Chemistry

链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c00395

01成果简介

2025年4月17日，萨塞克斯大学John Spencer团队等研究人员在JMC期刊上发表了题为“Structure-Guided Design of ISOX-DUAL-Based Degraders Targeting BRD4 and CBP/EP300: A Case of Degrader Collapse”的论文。

本研究设计了针对BRD4和CBP/EP300的双重活性降解剂。通过结构引导的设计方法，发现VHL招募基团能够介导BRD4的剂量依赖性泛素化，而基于沙利度胺的CRBN招募降解剂则无效。

通过高分辨率的蛋白共晶结构分析，发现了沙利度胺部分与BRD4 BD1的Trp81之间存在意外相互作用。这种相互作用导致E3连接酶配体与目标蛋白的结合位点被隔离，从而无法形成有效的三元复合物。基于此，提出了“降解剂失效（degrader collapse）”机制，即某些降解剂分子由于其结构特性，在目标蛋白降解方面可能处于非活性状态。这种“降解剂失效”现象可能是一种常见的机制，解释了部分降解剂分子对目标蛋白降解无效的原因。这一发现为后续靶向药物的研发提供了重要的参考依据。

02背景介绍

药理学抑制c-Myc蛋白被认为是一种有吸引力的癌症治疗策略。然而直接靶向c-Myc蛋白作为治疗策略具有挑战性。因此，研究者们通过抑制或降解上游和下游蛋白（如BET溴结构域和免疫细胞特异性转录因子IRF4）来间接靶向c-Myc。BRD4和CBP/EP300的抑制或降解已被证明可以降低c-Myc水平。

03图文概览

1）起始支架与出口向量的选择

图1. 起始支架与出口向量的选择

(A) CBP溴结构域与结合抑制剂2（5CGP）的晶体结构。(B) BRD4第一个溴结构域（5CFW）与同一抑制剂的结合结构，展示醚基（OMe）和吗啉基作为溶剂暴露的潜在出口向量。表面的赖氨酸残基以青色显示。(C) ISOX-DUAL化合物1和2的结构，展示了设计的酚醚与哌嗪出口向量的代表性结构设计。

通过共晶结构分析，选择ISOX-DUAL的溶剂暴露位点（酚醚和哌嗪基团）作为连接E3连接酶配体的位点，为后续降解剂合成提供基础。

2）降解剂的设计合成

分别针对酚醚和哌嗪离去基团策略，设计并合成了一系列 ISOX-DUAL 类似物和候选降解剂。通过多种化学反应，如偶联、环化、还原等，逐步构建目标分子结构，并对合成的化合物进行结构表征和纯度分析。

3）降解剂性能评估

运用荧光共振能量转移（FRET）测定法检测化合物与 BRD4 和 CBP 的结合亲和力；采用体外泛素化测定法来评估降解剂诱导目标蛋白泛素化的能力；通过X射线晶体学研究了降解剂与BRD4复合物的结构，以了解降解剂活性的结构基础。

图2. VHL 招募的降解剂（42−45）对BRD4 和CBP 的体外泛素化测定

利用毛细管电泳（Simple Western, Wes）和抗FLAG 及抗GST 抗体检测，直观展示了VHL 招募的降解剂在体外对BRD4 和CBP 的泛素化情况，表明这些降解剂能使 BRD4 发生剂量依赖性泛素化，但对CBP 无此作用。

图3. CRBN招募的降解剂（34 - 36）对 BRD4 和 CBP 的体外泛素化测定

同样采用上述检测方法，呈现了 CRBN 招募的降解剂在体外对 BRD4 和 CBP 的泛素化结果，显示仅最长连接子的化合物 36 对 BRD4 有有限的泛素化作用，对 CBP 无作用。

图4. 人BRD4第一个溴结构域与JQ1 和基于ISOX-DUAL的降解剂的复合物晶体结构

高分辨率晶体结构 (1.1-1.9 Å) 显示，降解剂14与母体支架BDOIA383 的结合模式相似；而哌嗪基降解剂34的沙利度胺部分与Trp81 相互作用，致降解剂折叠并阻碍CRBN结合，这可能是部分降解剂活性缺失的原因。VHL基降解剂44和45的共晶体结构表明，其连接子与靶蛋白的疏水表面区域相互作用，可能影响了降解剂的活性。

04结果讨论

出口向量在PROTAC技术中起着至关重要的作用。它不仅连接目标蛋白配体和E3泛素连接酶配体，还显著影响降解剂的活性、选择性、细胞渗透性和稳定性。该研究通过X射线晶体结构揭示E3连接酶招募配体与BRD4之间的意外相互作用，提出了“降解剂失效（degrader collapse）”概念，为PROTAC优化提供新视角。

这种 “降解剂失效” 现象可能是传统降解剂设计中一种此前未被充分认识的机制，或许值得对过去的失败案例进行重新研究，或者在未来实验结果与生化结合结果不一致的情况下，对复合物进行及时的结构评估。