引言

EBV（Epstein-Barr Virus）是一种人类疱疹病毒，也是首个报道的人类肿瘤病毒，全球约95%的成人经历过感染并终生携带EBV。虽然通常不产生严重症状，但EBV感染也有几率导致多种淋巴癌和上皮细胞癌，如鼻咽癌、霍奇金淋巴癌、伯基特淋巴癌、胃癌等。EBV相关癌症约占全球人类癌症负担的1.9%，每年导致约35万新增癌症病例，对人类生命健康产生巨大威胁。

潜伏期膜蛋白1（Latent Membrane Protein 1, LMP1）是EBV编码的关键致癌蛋白。1985年，Elliott Kieff课题组首次报道LMP1单一蛋白表达即能诱发B细胞的永生化，后续研究也相继发现LMP1通过模拟CD40信号参与B细胞和上皮细胞增殖和早期癌变。而与CD40不同，LMP1信号的激活不依赖任何配体，且LMP1介导的信号强度显著强于CD40。除了介导细胞转化和永生化，LMP1还参与调控多种重要生命活动，包括免疫应答（如核酸免疫通路、干扰素通路、细胞免疫等）、细胞因子和趋化因子分泌、细胞凋亡、细胞迁移、细胞互作、肿瘤侵袭和转移等。鉴于LMP1与EBV致病的高度关联性，以及LMP1在EBV相关恶性肿瘤中的广泛表达和分布，LMP1一直被认为是EBV阳性肿瘤鉴别诊断和靶向治疗的理想靶点。尽管目前对LMP1介导的下游功能有了较多认识，然而作为产生多样性功能的核心前提——即LMP1如何实现配体不依赖的组装和激活，仍然是困扰领域近40年的难题，也是影响LMP1靶向干预策略成功开发的重要阻碍。

中国科学院生物物理所高璞、高光侠、张立国合作团队经过6年多的科研攻关，揭开了EBV关键致癌蛋白LMP1自组装和组成性激活的神秘面纱，研究成果于2024年7月11日在线发表于Cell杂志——Assembly and activation of EBV latent membrane protein 1。该工作发现LMP1以一种全新且与此前猜测完全不同的机制进行寡聚自组装，并通过巧妙方式高效招募下游因子，从而激活和维持致病信号活化。另外，研究中发现的新机制和新界面，也为此前一些不清楚的现象提供了精确解释，并有望直接助力LMP1靶向干预策略的开发。

研究人员首先利用共聚焦显微镜进行细胞成像，发现LMP1在生理表达水平下会在膜上呈现为明显的聚集形态。进一步的超分辨成像表明，LMP1的聚集是一种宽度较为固定但长度不均一的细条状结构。这些结果表明LMP1可在膜上组装成有趣的聚集，但其分子层面的细节仍不清楚。为回答这一问题，研究人员计划解析LMP1在不同组装状态下的精细结构。然而，这一目标在过去近40年的研究中已被证明非常具有挑战性，主要是因为：1）性质良好的LMP1蛋白很难大量制备；2）LMP1核心跨膜区仅~20 KDa，且几乎无可识别的稳定水溶区。

经过大量尝试，研究人员解决了LMP1难表达、难纯化的问题，生化分析也提示LMP1在溶液中存在不同聚集状态。为辅助结构解析，研究人员进一步开展了系统性LMP1抗体筛选，获得了能够稳定结合LMP1跨膜区的鼠源单抗。通过抗体辅助策略，研究人员成功解析了LMP1两种意想不到的聚集态结构：轴对称二聚体和filament状高聚体。LMP1单体以一种全新的方式进行跨膜区折叠，进而通过反向平行叠合形成稳定的二聚体结构；LMP1二聚体是其进行更高级组装的基本单元，多个二聚体以“side-by-side”方式自组装形成filament状高聚结构。重要的是，这些高分辨率的结构信息，恰好符合活细胞成像所观测到的独特聚集形态，从而在不同分辨率尺度上揭示了LMP1的膜上聚集机制。

值得一提的是，由于目前PDB数据库中尚无任何LMP1的同源结构，LMP1多种状态（单体、二体及寡聚体）的真实结构均与AlphaFold2/3等软件的预测结果完全不同。而且，这种不同不仅体现在结构折叠的巨大差异，更为严重的是预测结果的基本拓扑学走向也完全错误。这提示在没有同源结构训练的情况下，我们对预测结构的使用需格外谨慎。从另一个角度来说，该研究中获得的LMP1多种聚集状态的真实结构，也为后续预测训练提供了全新且独立的折叠方式及组装模式。

LMP1在膜上的组装和聚集（Credit: Cell）

为进一步明确LMP1的功能形式，研究人员对二聚体和寡聚体界面分别进行了系统突变，发现其均会破坏LMP1在活细胞中的膜聚集形态，且均能阻断下游信号通路活化。这既证明了LMP1分子间互作的重要性，也明确了LMP1的寡聚filament结构才是其真正的激活状态。超分辨成像结果表明，LMP1在膜上的自发filament状聚集可包含几十至数百个LMP1二聚体单元。LMP1的这种聚集在很低蛋白水平下即可发生，且随着LMP1含量增加，多聚体的数量、强度和长度均呈现显著增长。这也是首次在较低表达水平下（类似病毒感染的表达水平），系统性观察到LMP1在膜上的超分辨动态聚集和组装。

有趣的是，作为LMP1的功能相关蛋白，宿主膜受体CD40的激活需依赖其配体介导的三聚体组装；而且，LMP1和CD40共同的下游信号因子TRAF蛋白，也是以三聚体形式发挥功能。因此，长期以来领域里普遍推测LMP1也应该是采用三聚体的方式来组装，这样才能更好的与下游因子进行衔接。而LMP1却是以二聚体为单元进行“side-by-side”方式的filament自组装，那么其是如何有效协调信号转导的呢？研究人员通过细致分析，发现二聚体单元中的两个LMP1的C端，可以和邻近二聚体中一个LMP1的C端，在空间上呈现近似等边三角行的巧妙排列。由于C端延伸的水溶区负责招募下游因子，因此这种filament自组装方式，结构上等价于多个LMP1“三聚体”平行密集排列，从而能够比CD40更高效招募下游因子和进行信号转导。此前研究也证实，如果将CD40 负责下游因子招募的C端水溶区连接到LMP1的跨膜区上，那么这种嵌合体蛋白的信号激活能力要显著强于原始的CD40。同时，研究人员也通过生化手段在体外重组了LMP1与TRAF复合体，利用电镜直接观察到LMP1的filament聚集确实可以同时招募多对TRAF三聚体。LMP1这种多位点且组成性的下游蛋白招募、激活方式，极大促进了信号转导强度，并有效维系了持续的增殖、癌变信号。

CD40与LMP1的不同激活机制（Credit: Cell）

综上所述，该研究报道了EBV关键致癌蛋白LMP1自组装和组成性激活的分子基础，为EBV-LMP1诱发致癌信号和调节免疫应答等生物学功能提供了新的理论模型。另外，该研究也为开发针对EBV相关疾病的干预手段提供了新思路，例如：1）鉴于LMP1二聚和寡聚对其功能至关重要，靶向这两个全新的互作界面可能是一种有效干预策略；2）LMP1单体极小的胞外区导致其极低的免疫原性，而本研究发现的寡聚组装为LMP1胞外区抗体的开发提供了全新表位信息；3）二聚体和多聚体状态的精细结构信息，为计算和设计靶向LMP1的结合分子提供了多个潜在靶向界面。

参考文献

责编|探索君

排版|探索君

文章来源|“BioArt”

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