在幼年时就聪明好学，小时候上学时，就沉迷于书中而不知疲倦。在九岁那年，于仲文拜见宇文泰，由于他的思想敏锐，学识丰富，被宇文泰赞赏。他长大后更是气度超凡，胸怀大志，他先当赵王的部下不久迁任安固太守。

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一次，任、杜两家都丢了牛，后来找到一头牛，两家都说是自己的，州郡无法决断。益州长史韩伯俊说：“安固于太守年少时就很聪明，可让他决断这事。”于仲文说：“这事很容易解决。”于是让两家各赶牛群来，放出那头牛，那头牛就奔向任家的牛群中。他又偷偷让人轻轻地伤了那头牛，任家人叹惜不已，而杜家人却没事一般。于仲文于是问责姓杜的，姓杜的认罪而去。后来，于仲文不畏强权有惩治了始州刺史屈突尚。蜀中人因此传语说：“明断无双有于公，不避强暴有次武。”

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杨坚在北周担任丞相后，尉迟炯起兵，并迅速攻占了黄河以南的地区。尉迟炯还派人诱招过于仲文，于仲文毫不犹豫地拒绝了，于是尉迟炯便派部下去进攻于仲文，最后于仲文成功击败尉迟炯，于仲文也因此被杨坚封为开府。

后来尉迟炯又带兵造反，声势非常浩大，东郡的人都很害怕。于仲文抛弃妻子，浴血奋战才侥幸逃脱，尉迟炯最后杀死了于仲文的子女和妻子，杨坚见到于仲文后都被于仲文感动得落泪。为了安抚于仲文，杨坚赐于仲文黄金二百两，还提拔他当大将军。公元581年，杨坚篡位，建立隋朝。于仲文因为受到叔父的牵连被捕入狱，在监狱中他向杨坚尚书自辩，最终杨坚将于仲文放出，还让他带兵驻扎在白狼塞，防备突厥。

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杨广即位后，于仲文逐渐不再受朝廷重视，大业八年，东征高句丽，于仲文大破高句丽军，活捉乙支文德，但是在刘士龙劝阻下，放了乙支文德。事后，于仲文非常后悔，以精兵追杀乙支文德。到了萨水，宇文述以士兵饥饿为由而退回，所以隋军失败。诸将都把罪过推给于仲文。于仲文经常和朝廷的奸臣起冲突，贤臣名将于仲文最终忧愤而卒。