排雷指南
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qPCR实验系列5 ————————»»»»
扩增曲线
&
溶解曲线
异常分析
做qPCR实验时
扩增曲线不稳定、溶解曲线杂峰······
这些“疑难杂症”是不是让你束手无策？
别慌！
今天，我们手把手教你
如何识别问题、找准原因
并附上精准的优化方案
助你快速搞定实验中的各种“拦路虎”！
扩增曲线异常
1. 扩增曲线不平滑
表现：曲线波动不平滑，背景信号不均。
原因：模板浓度过低或仪器波动导致信号不稳定。
优化方案：
提高模板浓度，重复实验。
检查并校准仪器性能。
2. 扩增曲线断裂或下滑
表现：扩增曲线未稳定提升，反而出现下降趋势。
原因：模板浓度过高或基线设置不当。
优化方案：
重新调整基线终点范围（如3-15改为3-10循环）。
重新分析数据，确认模板浓度适宜。
3. 个别扩增曲线骤降
表现：扩增过程中曲线突然下降。
原因：反应管内气泡破裂，信号采集失败。
优化方案：
提高模板浓度，重复实验。
检查并校准仪器性能。
4. 扩增曲线呈锯齿状且不连续
表现：曲线杂乱，重复性差。
原因：ROX添加不当，荧光信号校正失败。
优化方案：
确认ROX浓度和添加步骤是否正确。
重新调整反应体系，保证校正稳定。
5. 无扩增曲线或Ct值过大
表现：信号弱或完全无信号。
原因：热启动酶未充分激活，或模板浓度过低。
优化方案：
延长预变性时间至10分钟，激活热启动酶。
提高模板浓度或重新制备新模板。
6. 反应结束无扩增曲线
表现：扩增结束后无信号显示。
原因：循环数不足，或程序设置漏掉信号采集步骤。
优化方案：
增加循环数至40次，确保扩增充分。检查程序设置，确认信号采集步骤无遗漏。
qPCR实验系列5 · 扩增曲线异常分析
溶解曲线异常
1. 杂峰在主峰之前
表现：主峰前出现低温小峰（约70-75℃）。
原因：引物浓度过高或退火温度不合适。
优化方案：
调低引物浓度，适当提高退火温度。
提高模板浓度，减少二聚体干扰。
2. 杂峰在主峰之后
表现：主峰后出现杂峰。
原因：引物特异性差或气溶胶污染。
优化方案：
提高退火温度，增强引物特异性。
定期更换实验耗材，避免污染。
3. 主峰为引物二聚体
表现：仅有引物二聚体，无目的基因主峰
原因：扩增片段过短（<80 bp），难以区分产物。
优化方案：
将扩增片段长度设置在100-200 bp，提高扩增效率。
检查引物设计，避免二聚体形成区域。
qPCR实验系列5 · 溶解曲线异常分析
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实验出问题并不可怕
重要的是找准原因、对症下药！
希望本篇内容可以为你的qPCR实验排忧解难
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