聚前沿文献之声，解泌尿学术之惑

聚前沿文献之声，解泌尿学术之惑，这里是聚焦前列腺癌的《菲长视野 · 前献解泌》专栏。

本期与我们用声音见面的是四川省人民医院任尚青教授，他将与大家一同分享一项近日发表于《Cell》杂志（影响因子：64.5）的有关脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）甲基化在前列腺癌发生与发展中的作用的基础研究。

肿瘤细胞在DNA甲基化水平方面具有两种主要变化：（1）CpG岛局部高甲基化，通常位于基因调控区域，导致基因沉默，这是肿瘤抑制基因失活的一种机制；（2）低甲基化相关大型染色质结构域沉默，其对肿瘤发生的作用尚不明确。

肿瘤相关甲基化改变，在基于血液的肿瘤检测中具有相当大的分子诊断意义。这种检测主要依赖于血浆中循环短DNA片段（170 bp）上富集的CpG岛局部高甲基化。然而，在局限性前列腺癌患者中，只有11.2%可以通过血浆CpG岛高甲基化检测检出，因此，研究者进行了大量试验，旨在探索循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）中低甲基化结构域所提供的大基因组覆盖度能否在肿瘤检测中提供更多信息[1]。

● 临床样本

研究纳入在哈佛大学麻省总医院确诊为转移性前列腺癌、局限性前列腺癌的患者和年龄匹配但未确诊肿瘤的男性，并从中抽取10-20 ml血液用于CTC分析。在未经治疗的局限性前列腺癌患者中采集活检芯或手术切除的组织样本，请病理学专家在最低级别肿瘤（Gleason 6分）患者的组织样本中识别出正常前列腺组织，用作匹配对照。

● 细胞样本

从美国标准生物品收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）获取人前列腺癌细胞系（LNCaP、VCaP、PC3和22Rv1）、鼠前列腺癌细胞系（Myc-CaP）、人正常前列腺上皮细胞系（HPrEC）、人良性前列腺肥大细胞系（BPH-1）和鼠Lewis肺癌细胞系（LLC-1）。

● 实验动物

实验动物选用6-8周龄FVB雄性小鼠、6-8周龄雄性免疫缺陷NSG小鼠和6-8周龄C57BL/6雌性小鼠。

研究者首先建立了来自多个患者和癌细胞系的单个前列腺CTC中低甲基化结构域的全基因组，然后通过高分辨率单细胞亚硫酸盐测序（single-cell whole-genome bisulfite sequencing，scBS-seq）确定了转移性前列腺癌共有的40个核心低甲基化区域（partially methylated domain，PMD）。

● 鉴定单转移性前列腺癌细胞中共有核心PMD和保留甲基化岛（preserved methylation island，PMI）

为了描述单个转移性前列腺癌细胞的全基因组DNA甲基化特征，研究者富集了5例骨转移的去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）患者的CTC，进行了单个细胞显微操作和单细胞测序。将得到的44个单个CTC与40个来自4种前列腺癌细胞系（LNCaP、VCaP、PC3和22Rv1）和2种非转化前列腺上皮细胞系（人前列腺上皮细胞HPrEC和人良性前列腺肥大细胞BPH-1）的单个细胞进行比较。

图1 单个转移性前列腺癌细胞中的PMD和PMI

结果发现，正常细胞的甲基化分布是单峰的，有一个接近80%甲基化的单峰；而几乎所有的肿瘤样本都呈现双峰分布，有不同数量的低甲基化区域（图1D-F）。研究者在前列腺癌基因组中鉴定出1,496个PMD，平均大小为1.2Mb（范围250kb-9.2Mb）。通过染色体宽视图高分辨率单细胞甲基化分析，研究者发现一些PMD被更小的区域打断，其中DNA甲基化被保留，这就是PMI（图1D-F）。

为了证实前列腺癌中染色质的变化，研究者使用染色质免疫沉淀测序（Chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）分析人工培养细胞系的染色质图谱。结果显示，在PMI中表现出强烈的活化基因富集（H3K4me1/3、H3K27ac和H3K36me3），且缺乏抑制基因（H3K27me3和H3K9me2/3）（图2）。

图2 前列腺癌PMD获得性染色质标记和可能共有的核心PMD

综上，研究者在对前列腺癌细胞的单细胞分析时发现了一小部分普遍共有的PMD，称之为核心PMD。另外，一些PMD被更小的区域打断，它们保留着DNA甲基化，称之为PMI。

● 在前列腺癌发生早期，核心PMD低甲基化

确定了在单个转移性前列腺癌细胞中共有的核心PMD后，研究试图探索在肿瘤发生过程中始终受到早期沉默影响的基因组位点。研究者从前列腺切除标本中获得冷冻组织切片和纯化的单个细胞核，并进行分子分析。

结果显示，在早期的Gleason 6分前列腺癌中，77.5%（31/40）的核心PMD发生低甲基化，而仅有8%（115/1,456）非核心PMD发生低甲基化（图3B）。研究者在早期前列腺癌中观察到核心PMD加速进行性去甲基化，也观察到核心PMI保留甲基化的模式与Gleason评分无关（图3D）。

图3 早期前列腺癌发生过程中，核心PMD去甲基化抑制免疫相关基因，核心PMI保留了增殖基因

综上所述，在惰性Gleason 6分前列腺癌中，核心PMD开始发生DNA去甲基化，这是前列腺癌发生过程中最早可识别的变化之一。

● 核心PMD内免疫相关基因沉默，核心PMI内增殖基因持续表达

为了阐明早期DNA低甲基化的功能结果，研究者确定了位于核心PMD的蛋白编码基因。在核心PMD内20%（12/61个）的沉默基因与免疫相关。基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）显示，脂质抗原加工和呈递（P<1.96E-13）与细胞干扰素反应（P<2.74E-5）是两个富集程度最高的通路（图3E）。因此，免疫相关基因的沉默和编码增殖驱动因子的基因的选择性保留是前列腺癌发生的初始步骤。

● PMD相关CD1A-IFI16基因簇的沉默

CD1家族的脂质抗原呈递基因（CD1A、CD1B、CD1C、CD1D和CD1E）和干扰素诱导基因（IFI16、AIM2、PYHIN1和MNDA）聚集在染色体1q23.1的同一个核心低甲基化区（以下简称CD1A-IFI16）内（图4A）。CD1A-IFI16位点的DNA甲基化早期快速下降，在Gleason 6分前列腺癌PMD全基因组中为第14个最先下降的（图4B）。因此，CD1A-IFI16簇内的免疫相关基因是癌症低甲基化诱导转录沉默的最早靶标之一。

图4 CD1A-IFI16位点DNA去甲基化与染色质沉默标记积累和基因表达减少的相关性

● CD1A-IFI16位点低甲基化相关沉默的功能重现

为了研究DNA甲基化、抑制性染色质标记和PMD驻留基因表达之间的功能关系，研究者使用DNA去甲基化剂5-氮杂胞苷（5 μM）处理人前列腺上皮细胞（BPH-1）。与二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）对照相比，5-氮杂胞苷处理24h后BPH-1细胞整体DNA甲基化水平下降4.9%，处理5天后下降37.7%（图4F）。BS-seq测序证实在CD1A-IFI16位点逐渐去甲基化。异位诱导的去甲基化伴随着染色质沉默标记H3K27me3显著增加（图4G），CD1表达减少（图4H）。

随后，研究者使用EZH2甲基转移酶抑制剂GSK126来反向验证。用GSK126处理三种前列腺癌细胞系（22Rv1、LNCaP和VCaP）后，H3K27三甲基化缺失，CD1A-IFI16位点内所有基因表达的都显著增加（图4I-J）。综上，这些观察结果进一步证实了染色质沉默标记在抑制CD1A-IFI16位点和其他PMD内编码基因中的作用。

● 脂质抗原呈递或干扰素诱导基因重新表达可恢复小鼠模型的抗肿瘤免疫

为了探索CD1A-IFI16沉默的潜在意义，研究者在早期前列腺癌小鼠模型中探索了恢复CD1A-IFI16表达的结果。与FVB小鼠正常前列腺组织相比，Myc-CaP肿瘤细胞中主要的CD1鼠直系同源物Cd1d1和IFI16鼠直系同源物Ifi204受到抑制（图5A）。Myc-CaP细胞中异位表达Cd1d1不会改变其体外增殖能力，但将这些细胞在免疫功能正常的FVB小鼠皮下接种或在前列腺内注射时，小鼠并不会产生肿瘤（图5B-C）。将同样表达Cd1d1的Myc-CaP细胞接种到免疫缺陷NSG小鼠中并不会抑制原发性肿瘤的产生（图5D）。相似地，使Myc-CaP肿瘤细胞重新表达Ifi204后也可以抑制免疫功能正常FVB小鼠产生肿瘤，但并没有抗增殖的作用（图5B-C）。

综上，在DNA低甲基化诱导沉默的肿瘤细胞中，CD1或IFI16小鼠同源物的异位恢复表达可重新产生抑制肿瘤作用。

图5 免疫功能正常小鼠前列腺癌模型中，恢复CD1A-IFI16位点基因表达可抑制肿瘤发生

● 利用纳米孔测序检测血液标本中CTC来源的DNA低甲基化

研究者对前列腺癌细胞系VCaP进行了纳米孔测序，清楚地显示出DNA低甲基化结构域（图6A-B）。随后，研究者对来自局限性或转移性前列腺癌患者的CTC进行纳米孔测序。结果显示，23例年龄匹配的非肿瘤受试者DNA低甲基化信号最低（<0.6%），7例转移性前列腺癌患者中有6例（86%）低甲基化信号显著（0.62%-11.08% reads，P=0.00011），16例局限性前列腺癌患者中有6例（37.5%）低甲基化信号显著（0.62%-2.29% reads，P=0.004）（图6F-G）。因此，远距离低甲基化结构域是前列腺癌的普遍特征，并且可以从患者来源的血液标本中罕见的CTC中检测到。

图6 使用纳米孔测序检测血液标本中CTC DNA低甲基化

在本研究中，研究者通过单细胞DNA甲基化分析找到了前列腺癌核心PMD共有的低甲基化区域，同时也找到了PMI。核心低甲基化结构域相关基因沉默的一个显著特征是靶向免疫相关基因，包括整个CD1基因家族的单个染色体位点和干扰素诱导基因。相反，PMI保留了与细胞周期和DNA损伤修复途径有关的增殖相关基因的表达。因此，DNA甲基化改变可能在前列腺癌发展中具有重要作用，抑制DNA甲基化改变有助于促进新生肿瘤免疫监视基因的表达，同时也可抑制促进细胞增殖基因的表达。此外，本研究也提出了一种通过纳米测序检测前列腺癌的方法，这也为基于血液样本检测早期侵袭性前列腺癌提供了新的思路。

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。在哺乳动物中，DNA甲基化对于个体的生长发育是十分重要的，同时与许多关键的生物学过程密切相关。

在细胞癌变的过程中普遍存在着全基因组范围内的DNA甲基化水平下降，同时也有可能会出现部分基因CpG岛区域的DNA甲基化水平的上升。DNA去甲基化可导致基因组稳定性降低，在这个过程中出现了基因组重复序列的异常活跃，如基因组突变频率增加、多种原癌基因异常激活，进一步导致肿瘤恶化；同时，CpG岛DNA甲基化水平上升又会导致抑癌基因表达下调，进一步诱导恶性肿瘤的演化。

在肿瘤发生发展的早期阶段，很多肿瘤细胞的突变都能被免疫细胞有效识别，可以被迅速清除，这也是目前免疫治疗的基础机制。但肿瘤细胞可以改变自身特性，释放免疫抑制物质，躲避或是迷惑人体免疫系统的监管，进而产生免疫逃逸。肿瘤细胞DNA甲基化水平改变与肿瘤免疫逃逸的能力是否具有相关性，这个问题是目前肿瘤领域的研究热点。如果我们可以解释清楚前列腺癌发生发展的机制，将有利于前列腺癌治疗的进步。目前，雄激素剥夺治疗（androgen-deprivation therapy，ADT）仍然是前列腺癌的治疗基石。

前列腺癌是典型的雄激素依赖性肿瘤，以曲普瑞林为代表的ADT药物可降低前列腺癌患者睾酮水平，持续强效降低前列腺特异抗原（prostate specific antigen，PSA），延缓疾病复发。一项回顾性汇总分析纳入9项评估曲普瑞林1月、3月和6个月剂型治疗晚期前列腺癌有效性的前瞻性临床研究，共计纳入患者920例，其中128例接受曲普瑞林6月剂型治疗，主要终点是患者治疗后血清睾酮浓度和达到深度降酮（睾酮水平<20 ng/dl）的患者比例[2]。结果显示，接受曲普瑞林6月剂型治疗组中第6、9及12个月达到深度降酮的患者比例分别为94%、92%与91%，在研究结束时中位睾酮水平为8.7（5.8-14.1）ng/dl[2]。此外，南非一项开放标签、非比较III期研究纳入了120例晚期前列腺癌患者，结果显示，患者接受曲普瑞林6月剂型治疗29天时，97.5%的患者睾酮可达到去势水平（睾酮≤50 ng/dl），且在第2-12个月治疗期间93.0%的患者可维持去势状态[3]。不仅如此，患者在第6个月和治疗结束时，中位PSA相对于基线时分别降低97%和96%[3]。

目前，曲普瑞林6月剂型已在中国上市，使我国患者同时拥有1月、3月、6月三种不同剂型选择，为前列腺癌患者带来了超长效的管理方案。希望随着前列腺癌管理向慢病化的不断发展，患者因前列腺癌死亡的会风险越来越低，从而更好地实现高质量的“无癌感”生活目标。

专家简介

任尚青 教授

四川省人民医院

医学博士，达芬奇机器人全球注册主刀医师，四川省医学科学院·四川省人民医院机器人微创中心规培医师导师，擅长机器人微创手术，以前列腺癌及尿路上皮癌为专业方向，擅长泌尿系肿瘤的全程管理与治疗

主持四川省科技厅重点项目1项，四川省干保课题1项。第一及通讯作者发表SCI文章20余篇，核心期刊10余篇，参编专著1部，专家共识1部。多次参加国内外学术会议包括SIU、CUA、CSCO等进行口头发言及壁报交流。完成2022年度美国约翰霍普金斯临床科研培训项目

中华医学会泌尿外科学分会（CUA）微创学组青年委员

中国自动化学会医学机器人专业委员会委员

四川省医师协会医学机器人和人工智能分会委员兼秘书长

四川省医师协会机器人外科医师分会委员

四川省国际医学交流促进会肿瘤分子靶向治疗专业委员会委员

四川省医学会医用机器人和医学智能化专业委员会青年委员会副主任委员

美国科学家荣誉协会SIGMA-XI正式会员

成都高新医学会泌尿外科专委会委员

成都市人工智能产业协会医疗人工智能专委会委员

参考文献

1. Guo H, et al. Cell. 2023, 186(13): 2765-82.e28.

2. Breul J, et al. Adv Ther. 2017 Feb;34(2):513-523.

3. Lundström E A, et al. Clin Drug Investig. 2009, 29(12): 757-65.

编辑：Nobody

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