文：回溯档案

编辑：回溯档案

近年来黑斑矮化病毒(SRBSDV)严重影响水稻产量，这是由于受感染的媒介和水稻植株的寿命有限，而且媒介的病毒采集和接种效率低。同时由于单叶植物叶中木质素含量较高，传统的病毒机械接种仅适用于双子叶。

因此，建立高效、持久的病毒传播模型，缩短病毒传播时间，提高病毒传播效率，筛选新型抗srbsdv药物，是当前的迫切需要。

SRbsdv传输

将经过处理的幼苗浸泡在粗srbsdv提取物中30分钟，用srbsdv为幼苗接种疫苗，在28~30℃的黑暗环境下孵化为期3天，然后将水稻幼苗种植在土壤基质中，在相对湿度为50%、温度为28-30℃、光/暗周期为14/10小时的情况下孵化25天。

从水稻植株上采集样品，并在-80度C度维持样品，直至确定SRbsdv的传输效率和srbsdv蛋白的特性所需，最后在试验田种植水稻幼苗观察任何疾病的症状。

实验计划

在实验室中，通过模拟自然环境的方法，传统上是由一种远距离迁徙害虫传播，当水稻感染srbsdv时，其症状往往会发展为茎发育迟缓、深绿色和扭曲的叶子、叶脉上白色蜡质肿胀等。

然而，在感染开始时症状并不明显，因此应用聚合酶链反应、酶联免疫吸附法和逆转转录转导等温扩增法等几种方法来诊断srbsdv感染，与此同时，聚合酶链反应梯度凝胶电泳已被用于测量不同温度下，srbsdv在不同寄主植物中的传递效率及其特性的变化。

在以前曾报告过一种新的方法，即依靠水稻悬浮细胞，可以测试抗病毒化合物对srbsdv;用实时定量PCR测定srbsdv的传播效率，在本研究中，首次报道了一种新的在水稻中传播srbsdv的方法，该方法采用预算切割法生成了一种可靠的感染srbsdv的水稻供应，用于筛选新的抗srsdv药物。

结果表明，SSRbsdv可以通过预算切割成功地传播，感染SSRbsdv的植株表现出的症状与WBPH相似，同时通过PCR方法研究了srbsdv在水稻中的传播效率，该方法是一种高效的持续性传播方法，病毒传播时间较短，病毒传播效率较高，蛋白质组学分析表明，srbsdv在整个水稻生长期也能复制，这是第一次使用水稻芽切割法进行水稻srbsdv传播的报道。

DNA提取、cDNA合成和PCR分析

根据制造商说明书中的说明，从样品中提取的总RNAS是通过使用一种三唑试剂盒取的，用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，并通过计算总RNA纯度来估计RNA的纯度，并根据稀释率和氧化物浓度计算总RNA浓度。

还利用塔卡拉的cDNA合成试剂盒合成了CDNA，将随机引物和总RNA添加到H中 2 在42℃温度下加热1小时，然后在70℃温度下加热15分钟，然后，溶液被迅速放置在冰上冷却2分钟。

在此之后，在上述溶液中加入了2个5×莫洛尼小鼠白血病病毒缓冲区、500个10mmDNTP缓冲区、250个RN酶抑制剂和500个M-MLV逆转录酶，最后，在热循环器中，PCR扩增条件设定为:30℃时10分钟，42℃时1小时，70℃时15分钟。

蛋白质提取、质谱和蛋白质鉴定

蛋白质提取程序是以酚萃取法为基础，首先，每一个集合样本被冷冻在充满液氮的情况下，然后它们被磨成细粉末，提供了5毫升的蛋白质提取缓冲冰冷温度，其中包括0.5米三氯甲烷，0.7%m蔗糖，0.1米kcl，50毫米EDTA和40毫米二硫三醇，用于在室温下悬浮15分钟。

在震动30分钟前，在悬浮液中加入5毫升三氯酚，然后将悬浮液离心至8000 g 在摄氏4度持续5分钟，收集上酚醛相，并添加等量萃取缓冲液到上清剂，向上清液中添加4卷溶于甲醇的0.1米醋酸铵，然后在-20℃下一夜离开，以实现蛋白质沉淀的目的。

下一步，离心8000后丢弃上清液g在摄氏4度10分钟，在4℃时用丙酮将球洗三次，将颗粒在真空干燥器中干燥2小时，然后在再水化溶液中溶解，此外，用布拉德福法测定蛋白质浓度。

通过使用LC-MS/MS系统，测量了从大米中提取的蛋白质的总肽，采用质谱仪与纳米液相色谱图耦合进行了所有的分析，首先，将八升双峰肽自动注入六端口阀门中，并采用双峰捕集柱脱盐10分钟，速度为2升/分钟。

第二，采用梯度洗脱法，用分析柱-NLCC分离了保留的肽， 18 反相柱18 -cl，75米x15厘米，速度300nl/分钟，有95%的溶剂b和95%的溶剂a。前者包括95%乙腈、5%高效液相色谱级水和0.1%v甲酸，而甲酸的含量为5%、95%高效液相色谱级水和0.1%。

第三，使用了分析员系统软件来操作5600个三自由度MS，并能够在TTO-MS和产品离子获取之间自动切换，最终，数据是在选择300-1600米/Z的范围后收集的，此外，aβ -使用半乳糖酶消化标准对质谱仪进行再校准，在完成每个样品的流动路径运行和应用2.3kv的高压进行稳定的喷雾操作时，使用分析软件可以控制LC泵，自动质谱获取和质谱仪。

实验症状

在苗期早期感染的植株表现为侏儒和硬叶，早期分耕期的感染表现出过度的矮化和分耕，当感染时，在延长阶段，植株发育小穗与贫瘠的谷物和粮食重量低，受感染的叶子很短，深绿色，坚硬。

此外，在上叶的表面可以看到褶皱，延长后，航空根出现在节点，茎上出现黑色或白色的小而有条纹的突起。

SRBsdv传输效率的测定

感染样本序列与已知的SRBSDVS7-1序列和S9-1序列的比较表明，序列识别率为99%。利用PCR结果，计算了SRBSDV在水稻植株上的传播效率，并在其他文件中找到了PCR电泳图，在试验1、2和3的试验中，通过割芽方法在受感染水稻幼苗中的srbsdv传播效率分别为90.00%、91.67%和88.89%。

蛋白质识别

用蛋白质组学方法在受感染的水稻幼苗中进行鉴定，结果表明，通过割芽方法成功地将srbsdv传播到水稻植株上，每一种蛋白质受到肽攻击的详细数据在其他文件中显示。

研究srbsdv昆虫媒介--宿主植物之间的相互作用经常受到以下因素的阻碍:由于受感染媒介和水稻植株的寿命有限，以及该媒介的病毒采集和接种率低，病毒样本不足。

以往的研究报告指出，病毒的最低获取期为2至8分钟，不仅对女性前列腺增生性淋巴结炎的成年人，而且对其进行30分钟的接种，病毒循环传播的时间从3天到14天不等。

此外，大多数受感染的人在断断续续的时期内传播病毒，这种时期为2至6天，与此同时，从受感染的水稻植株到健康的水稻幼苗的巨翅目和翅足目成年人的srbsdv传播效率在15℃时为23.7%，25℃时为53.6%，35℃时为7.3%

与此相反，本研究详细地确定了srbsdv在水稻中的病毒传播能力，并证实了该方法是一种高效的持续传播方法，病毒传播时间较短，病毒传播率较高。

由srbsdv引起的水稻病在宿主的不同生长阶段产生与水稻黑斑矮化病毒(rbsdv)类似的症状，在本研究中，我们获得了类似的疾病症状，观察到在水稻植株感染srbsdv，由WBP-H载体，这些症状可表现为:在苗期早期出现矮化和硬叶;小穗、不毛之粒、在延伸期出现不正常的短绿色和暗绿色叶，并有皱褶;空中根和节上的分枝，以及茎上的小条纹蜡质，这与先前研究报告的结果一致。

一些研究表明，srbsdv由二十面体的微粒组成，由10段组成，其定义为S1至S10，主要范围为4.5至1.4kb，与rbsdv相比，srbsdv编码6个假定的结构蛋白至少，分别指假定的rna依赖rna聚合酶、核心蛋白、假定的封顶酶、外壳B蛋白、假定的核心蛋白和主要的外壳蛋白。

此外，srbsdv编码了五种假定的非结构蛋白，其中P6是指非宿主昆虫细胞中的一种病毒性沉默抑制剂和小管，通过细胞内病毒质体的形成，P9-1在病毒的早期生活中起着必不可少的作用，在此，我们采用蛋白质组学方法，在受感染的水稻幼苗中识别srbsdvP1、P-2、P-3、P-4、p5-1、p5-2、p6、p8、p9-1、p9-2和p10蛋白，这进一步验证了使用预算切割法成功地传播srbsdv。

不幸的是，在本研究中，srbsdvp7-1和p7-2蛋白在受感染的水稻幼苗中没有检测到，P7-1和P7-2蛋白的不可检测表达水平可能是由于缺乏传递载体，SRbsdvP7-1蛋白是一种病毒移动蛋白，最近有报道称它能诱导昆虫细胞形成管状结构，并在通过昆虫媒介传播病毒方面发挥关键作用。

有趣的是，我们先前的研究显示，在受感染的水稻植株中，可透过昆虫载体检测到srbsdvP7-1蛋白，相比之下，在本研究中，srbsdv在没有昆虫载体的情况下成功地传播到水稻植株上，因此，srbsdvP7-1蛋白无法通过蛋白质组学方法在受感染的水稻幼苗中检测到。

与此同时，RbsdvP7-2蛋白及其对应蛋白被认为与植物病毒增殖或植物病毒致病性有关，然而，文献报告说，在过去二十年中，在感染的植物或昆虫中，srbsdvP7-2蛋白没有被发现，这个结果与我们目前的研究结果是一致的，其中srbsdvp7-2蛋白还没有在srbsdv感染的宿主中得到鉴定。

结语

本研究结果表明，通过插穗法可以成功地将srbsdv从受感染的水稻幼苗中传播到健康的水稻幼苗中，该方法使病毒传播时间缩短，传播效率也高于该方法。

使用预算切割法生产廉价、高效、可靠的、受srbsdv感染的水稻幼苗，应有助于制定疾病控制战略，该方法也可为其他病毒在单核植物中的传播提供新的思路。

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